一种多通道酶标仪的研制

于学龙，郈秀菊，张素文，李红梅，刘阳，钟华风，李俊起

(山东省药学科学院，济南 250101)

1 引 言

酶标仪广泛应用于临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，是对酶联免疫吸附试验结果进行读取和分析的专业仪器。其依据酶标记的复合物与酶的相应底物能够产生显色反应，显色的深度与被测样本的浓度正相关，不同物质有其特有的特征吸收谱线，并遵守朗伯比尔(Lambert-beer)定律，可根据显色物质吸光度值定量测定物质的含量[1-2]。Lambert-beer定律的表达式如下：

(1)

式中,A为吸光度；T为透射比，等于出射光强度(I)比入射光强度(I0)；K为摩尔吸光系数，与吸光物质和入射光的波长λ有关，单位为L/(g·cm);B为吸收层厚度，单位为cm;c为吸光物质的浓度，单位为g/L。

目前国内生产的酶标仪比较简单、测量精度低，高档的酶标仪仍以进口为主[3]。为了实现高稳定性、高精度、快速检测的目标，本研究基于双CPU的控制方案，样本区域采取恒温控制，采用一路参比信号通道和十二路检测通道[4]，设计了一种可快速检测12×8(96)微孔板和12×32(384)微孔板的多通道酶标仪。

2 方法

2.1 光学系统

本酶标仪的光学系统结构见图1，采用卤素灯做光源，波长范围340～800 nm，其发出的光经过平面反射镜照射到聚光透镜上，再经过滤光片变成单色光[5]，在光纤接头处形成一个单色的光斑(光斑直径大于光纤接头的直径)。光纤将单色光引导到参比通道(1路)和检测通道(12路)，单色光自下而上照射通道内的样本(参比通道内无样本)，透射光照射到通道上方的光电池，光电池把透射光信号成比例转换成电信号，经过前置放大器的放大作用转换为可供单片机使用的电压信号[6-7]。本酶标仪配置405、450、490、630 nm四个滤光片，预留四个选配滤光片位置，最多可安装八个滤光片。

图1 光学结构图Fig.1 Optical structure diagram

2.2 电路结构

采用宏晶科技有限公司的STC15W4K40S4和STC15F2K40S2组成双CPU结构，见图2。直流电源模块输出5 V和24 V电压，其中5 V供给单片机系统，24 V供给两个步进电机驱动器和卤素灯驱动器。一个步进电机驱动微孔板进出酶标仪的检测舱室；另一个步进电机驱动滤光片架，便于调整滤光片。STC15W4K40S4为主控单片机，是8位单周期单片机，有40 K片内flash存储器、18 K的EEPROM、4 K的SRAM，还具有4组独立的异步串行通讯接口，通过分时切换可当作9组串行接口使用。4组串行接口通过电平变换以后，可分别与液晶触摸屏、打印机、U盘、PC上位机连接。液晶触摸屏显示酶标仪的相关信息，并且可以输入指令；打印机输出测试结果；U盘可存储相关信息，用于转移到其他设备上；利用PC机强大的数据处理能力与PC上位机进行数据通讯。主单片机通过16位的模数转换器AD977将经过前置放大的光电池[8]信号转换成数字信号。主控单片机与从单片机STC15F2K40S2通过串行接口进行通讯。主控单片机通过两路THB6128驱动微孔盘托架步进电机和滤光片架步进电机，通过一路L296控制卤素灯开关。

图2 电气控制框图Fig.2 Block diagram of electrical control

从单片机STC15F2K40S2也是8位单周期单片机，有40 K片内flash存储器、21 K的EEPROM、2 K的SRAM，具有2组独立的异步串行通讯接口。从单片机控制2个风扇、3个加热器，为酶标仪内部供应热空气，并通过6个热敏电阻实时检测相应位置的温度，确保样本区域的温度恒定，提高酶标仪整体的检测精度和稳定性。

2.3 软件控制

软件设计采用模块化编程的思路，用C语言编写各个模块[9]，总程序的流程见图3。软件部分共有测试、设置、分析、数据、维护五个模块,见图4。测试模块控制线性校准和样本测试；设置模块用于设置当前检测所使用微孔板的规格、滤光片的规格以及所需恒温的温度值；分析模块用于选择合适的方法经，处理检测得到的数据；数据模块用于选择数据存储的型式和数据转移；维护模块用于确定关键配件的更换信息。

图3 软件流程框图Fig.3 Software flow diagram

图4 软件部分Fig.4 Software part

2.4 机械驱动

采用两相混合式步进电机驱动微孔板托架和滤光片架的移动，采用THB6128芯片驱动步进电机。该芯片具有双桥MOSFET驱动，导通电阻低至0.55 Ω，驱动电压高达36 V，有多种细分可供选择，最高到1/128细分，可有效保证微孔板托架和滤光片移动位置的准确性。步进电机驱动电路见图5。

图5 步进电机驱动电路Fig.5 Stepper motor drive circuit

3 检验

我们根据《JJG 861-2007 酶标分析仪检定规程》的要求，采用重铬酸钾标准溶液对酶标仪进行校验，重点对吸光度和通道差异性进行测量[10-12]。对酶标仪配备的405、450、490、630 nm四个滤光片分别进行校验，由于其过程相同，我们仅对405 nm滤光片的校验过程和结果进行研究。

使用Sartorius BT125D天平称量分析纯重铬酸钾0.500 g，少量蒸馏水溶解，加100 μL浓硫酸，使用100 mL容量瓶溶解，作为基准原液(浓度0.500%)。用蒸馏水对基准原液进行倍比稀释，取得浓度分别为0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.00731%的稀释液。

使用岛津UV-2700分光光度计，设置波长为405 nm，测试结果作为吸光度标准值As；酶标仪选用405 nm的滤光片，选用第一路通道，进行吸光度示值误差测试。进行比对的结果见表1。吸光度示值误差△A按照式(2)进行计算，每个浓度值测量三次，依次进行计算。

表1 各种浓度的示值和吸光度示值误差Table 1 Errors of indications and absorbance indications of various concentrations

(2)

式中，Ai为同一浓度的重铬酸钾标准溶液第i次测量得到的吸光度值。As为吸光度标准值。

选用吸光度标称值为1.0的光谱中性滤光片[13]放置在酶标仪微孔板的托架上，酶标仪选用405 nm波长的滤光片，依次进行十二个通道的吸光度值测量，每个通道测量6次，按照式(3)计算通道差异δA。

δA=Amax-Amin

(3)

式中，Amax为多个通道中测量的吸光度的最大值。Amin为多个通道中测量的吸光度的最小值。δA为通道差异。

通过测量，吸收度最大值Amax为1.022，最小值Amin为0.995，δA=0.027，低于0.03，符合要求。

4 结论

本研究设计了一种可以检测96微孔板的12通道酶标仪，通过稳定的温度控制，可实现快速、精确地测量。通过校准检验可实现吸光度示值误差小于0.015，通道差异小于0.03，基本满足实际使用的要求。但在功能方面只能检测吸光度，后续应考虑扩展荧光和化学发光的检测。此外，为了进一步提高测量结果的可靠性，应考虑采用双波长测量方法；在数据输出方面，还需要丰富数据计算和处理能力，增加打印报告格式的种类，以增加检测项目。以上不足之处，还需在后续的工作中进一步作出改进和完善。