米曲霉奶酪发酵剂培养条件优化

吴 琛，陈 旭，李馨宁，史海粟，李彦博，王儒红，樊 浩，陶冬冰，武俊瑞，乌日娜，岳喜庆

（1.沈阳农业大学 食品学院，沈阳110161；2.辽宁省食品检验检测院，沈阳110015）

霉菌奶酪是采用霉菌作为发酵菌种的一类奶酪的统称[1-3]，是全球销量持续增长的一种传统乳制品，现主要分布在美国、欧洲等地[4-6]。 随着我国居民生活水平的提高，霉菌奶酪也正在被更多中国人所接受，霉菌奶酪食品引入我国市场已成为大势所趋[7-8]。 我国霉菌奶酪产业正处于起步阶段，并且我国奶酪工业相对落后，因此限制了该行业的发展[9]。 因此，开发出适合中国人口味的霉菌奶酪，将会促进中国霉菌奶酪产业的发展，增强霉菌奶酪产业的竞争力。

目前，应用于霉菌奶酪制作上的菌种有限，主要来源于传统霉菌附属发酵剂，多采用白地霉作为霉菌奶酪的发酵菌种[10-14]，最新研究也有研究者为了扩大消费市场以及丰富霉菌奶酪的品种使用传统发酵食品中获得的青霉[15]、毛霉[16]、红曲霉[17，18]、白霉[19，20]等菌种作为发酵剂。 但从感官评价上大多数霉菌奶酪不能满足我国霉菌奶酪市场[21]，因此，开发霉菌奶酪发酵新菌种以及改善其发酵条件势在必行。

本研究从前期在农家豆酱中筛选到的米曲霉为研究对象，在将其应用于霉菌奶酪制作之前，首先优化了米曲霉的培养条件并提高蛋白酶活力，为后续米曲霉作为发酵剂，制作新型霉菌奶酪提供较优培养条件，并提高米曲霉产中性蛋白酶和碱性蛋白酶培养条件，以期为霉菌奶酪品质改良提供霉菌添加量、发酵条件等参数支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 米曲霉菌株由沈阳农业大学食品学院微生物实验室前期筛选并保藏。

1.1.2 培养基 虎红（孟加拉红）琼脂培养基：蛋白胨5g·L-1，葡萄糖10g·L-1，琼脂15g·L-1，磷酸二氢钾1g·L-1，硫酸镁0.5g·L-1，孟加拉红0.03g·L-1。 自然pH 值，121°C 灭菌20min。

1.2 仪器设备

电热恒温培养箱（HH·Ⅱ420-S，上海跃进医疗器械厂）、电子天平（PL1501，梅特勒-托利多公司）、蒸汽压力灭菌锅（LDZX-40B1，日本三洋电子有限公司）、恒温振荡器（THZ-98A，上海一恒实验设备有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（101-1-S，上海跃进医疗器械厂）、超净工作台（CJ-IB，北京半导体设备一厂）。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

1.3.1.1 碳源试验 培养基中分别加入10g 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉作为碳源，代替初始培养基中的葡萄糖，将培养基分装在250mL 三角瓶中，装液量为70mL，每瓶接入一环孢子，接种后置于30℃摇床中进行培养，摇床转速为200r·min-1，发酵周期48h[22]。 发酵结束后用3 层纱布过滤，洗涤菌丝体3 次，所得菌丝体70℃烘干24h，称重，每个因素3 个重复，取平均值。

1.3.1.2 氮源试验 培养基中分别加入5g 酵母粉、硫酸铵、硝酸钾代替原始培养基中的蛋白胨。 后续试验同

1.3.1.1 。

1.3.1.3 温度试验 设置摇床温度分别为26，28，30 和32℃，转速200r·min-1，将分装好的培养基发酵培养48h。米曲霉生物量测定同1.3.1.1。

1.3.1.4 pH 值试验 将pH 值分别为6.0，6.5，7.0，7.5 的培养基置于30℃、200r·min-1摇床培养48h。 米曲霉生物量测定同1.3.1.1。

1.3.2 响应面试验设计 在上述单因素试验基础上，选取碳源、 氮源、 温度3 个因素， 采用Box-Behnken 设计法，设计响应面试验，对单因素试验进行优化。

1.3.3 米曲霉中蛋白酶活力测定 参照OZTURKOGLUBUDAK 等[23]方法，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白测定法定量米曲霉菌株上清液中蛋白酶活力。 以0.25，0.50，1.0，2.0，3.0，5.0μg·mL-1胰蛋白酶制作标准曲线得到蛋白酶活力标准曲线，在激发波长、发射波长分别为485nm 和530nm 时测定样品相对荧光，获得蛋白酶活力。 酶活力定义：米曲霉培养滤液中每分钟每克总蛋白释放的胰蛋白酶微摩尔的当量（U·g-1）。

1.4 数据处理

用Excel 2010 软件整理数据，使用SPSS 22.0 软件对数据进行方差分析和相关性分析，方差分析选取Duncan 检验，在p＜0.05 检验水平上对数据进行统计学分析；运用数据分析软件Design Expert 8.0.6.1 对响应面试验结果分析，确定米曲霉培养最佳条件。

表1 因素水平编码Table 1 Code table of factor levels

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对米曲霉生物量的影响

2.1.1 碳源对米曲霉生长影响 米曲霉在pH 值7.0，30℃条件下恒温培养48h，考察不同碳源对米曲霉生物量的影响。 由图1 可知，米曲霉在不同碳源培养基中生长表现出显著差异，在麦芽糖和葡萄糖中生长状态良好，生物量分别达到（2.20±0.06）g·L-1和（1.80±0.15）g·L-1。 可溶性淀粉和蔗糖对米曲霉生物量影响差异较小，10g·L-1可溶性淀粉或蔗糖添加量时，生物量分别为（1.20±0.03）g·L-1和（1.40±0.06）g·L-1，显著低于麦芽糖和葡萄糖。麦芽糖作为麦麸中的主要碳水化合物，是理想的固态发酵培养和产酶培养碳源[24]，可促进米曲霉的生长，增加菌株生物量。 在可溶性淀粉和蔗糖分别替代葡萄糖作为碳源时，菌株生物量显著降低，说明单糖作为碳源具有一定优势，但麦芽糖作为碳源，米曲霉生物量显著高于葡萄糖，说明麦芽糖的分子结构优于可溶性淀粉和蔗糖，更利于米曲霉分解代谢。

2.1.2 氮源对米曲霉生长影响 米曲霉在pH 值7.0，30℃条件下恒温培养48h，考察不同氮源对米曲霉生物量的影响。由图2 可知，米曲霉在不同氮源培养基中生长存在显著差异。在以酵母粉为氮源的培养基中生物量达到最高值（2.00±0.13）g·L-1，蛋白胨为氮源培养基中生物量为（1.80±0.04）g·L-1，硫酸铵为氮源培养基中生物量为（0.80±0.04）g·L-1，硝酸钾为氮源培养基中生物量最低值为（0.60±0.05）g·L-1。 以蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾为氮源时，米曲霉生物量依次降低10%、60%、70%。 米曲霉在有机氮源中的生长显著优于无机氮源，而有机氮源中酵母粉的利用效果优于蛋白胨，在米曲霉培养时应优先选用有机氮源。

图1 10g·L-1 碳源对米曲霉生物量影响Figure 1 Effect of 10g·L-1 carbon source on biomass of A.oryzae

图2 10g·L-1 氮源对米曲霉生物量影响Figure 2 Effect of 10g·L-1 nitrogen source on biomass of A.oryzae

2.1.3 温度对米曲霉生长影响 当pH 值7.0、培养48h 时，考察不同温度对曲霉生物量的影响。 由图3 可知，在26～32°C 温度范围内，米曲霉生物量随温度上升呈现先上升后下降趋势，在30°C 生物量达到最高值为（2.10±0.12）g·L-1，显著高于26，28，32°C。 不同培养温度主要影响米曲霉中酶系活性，进而调控菌株的生长代谢，促进或抑制霉菌生长。 培养温度变化显著影响米曲霉的生长，温度会影响膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性以及影响RNA 的结构和转录，在分子水平影响霉菌的生长代谢，使米曲霉生物量发生显著变化。 温度的微小变化即可对菌株产生明显影响，在霉菌生长过程中应严格控制培养温度，以期获得最高生物量和最佳酶活力。

2.1.4 pH 值对米曲霉生长影响 pH 值影响菌体细胞膜电荷性质的变化和微生物代谢过程中酶的活性。 米曲霉在30°C 恒温培养48h，观察不同pH 值对米曲霉生物量的影响。由图4 可知，pH 值6.0～7.0 时，米曲霉生物量呈上升趋势，由（1.70±0.03）g·L-1增加至（2.10±0.02）g·L-1，pH 值7.5 时生物量为（2.00±0.04）g·L-1，略有下降。 不同pH 值显著影响米曲霉生物量，pH 值在7.0～7.5 范围内， 米曲霉能够保持良好的生长状态， 生物量保持在[（2.10±0.02）±（2.00±0.04）]g·L-1范围内。

图3 不同温度对米曲霉生物量影响Figure 3 Effects of different temperatures on biomass of A.oryzae

图4 pH 值对米曲霉生物量影响Figure 4 Effect of pH on biomass of A.oryzae

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计优化结果 根据表2 安排试验，对试验结果回归拟合所得回归模型为：

表2 Box-Behnken 设计方案及试验结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model

由表2 和表3 可知，相关系数R2=90.99%，响应面回归模型高度显著（p≤0.0004），模型失拟项（p≤0.1439）不显著，说明该二次模型可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

由表3 可知，A、B、C 的p 值分别为0.6291，0.0014，0.0069，因此确定因素影响顺序为：B＞C＞A

依据回归模型的数学分析并综合响应图5、图6、图7 确定最佳培养条件为：麦芽糖15.30g·L-1，酵母粉11.60g·L-1，温度30.80°C。 回归模型预测生物量为2.19g·L-1。

取麦芽糖15.30g·L-1，酵母粉11.60g·L-1，温度30.80°C，试验重复3 次。 3 次平行试验的米曲霉生物量分别为2.21，2.17 和2.25g·L-1，平均生物量为2.21g·L-1，与理论预测值相比相对误差为0.002g·L-1，可见该模型能较好地模拟和预测培养条件对米曲霉生物量的影响。

图5 Y=f(A，B)的响应面与等高线Figure 5 Response surface and contour of Y=f(A,B)

图6 Y=f(A，C)的响应面与等高线Figure 6 Response surface and contour of Y=f(A,C)

图7 Y=f(B，C)的响应面与等高线Figure 7 Response surface and contour of Y=f(B,C)

2.3 米曲霉中产蛋白酶活力影响因素

2.3.1 培养基组成对产蛋白酶活力影响 米曲霉在自然pH 值，30°C 恒温培养48h 时，考察不同碳氮比对蛋白酶活力的影响。 由表4 可知，分别以麦芽糖、酵母粉为碳源和氮源，随着碳氮比的增加，中性蛋白酶活力逐渐增加，由（296.7±0.7）U·g-1升高至（412.2±0.4）U·g-1，酶活力提高38.9%。碱性蛋白酶活力先增加后降低，在C∶N=4∶1时，酶活力最高值为（335.1±0.3）U·g-1。 不同培养基组成对米曲霉蛋白酶活力影响显著，中性蛋白酶活力明显高于碱性蛋白酶且中性蛋白酶活力稳定性较高，碱性蛋白酶活力波动明显，受碳氮比影响较大。当C∶N=4∶1 时，米曲霉中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力分别达到最高值（412.2±0.4）U·g-1和（335.1±0.3）U·g-1，此时米曲霉蛋白酶活力最高，代谢活力最强。

2.3.2 培养基pH 值对产蛋白酶活力影响 在C∶N=4∶1，30°C 恒温培养48h 时， 考察不同培养基pH 值对蛋白酶活力的影响。 由图8 和图9 可知，pH 值分别为6.0，7.0，7.5 时，米曲霉中性蛋白酶活力分别为（410.4±0.9），（408.5±0.01）和（395.4±0.4）U·g-1，显著低于pH 值6.5 时中性蛋白酶活力[（530.2±0.4）U·g-1]。pH 值对蛋白酶活性的影响主要为破坏酶的空间结构，影响酶活性部位催化基团的解离状态和底物解离状态。在pH 值为6.5 时，蛋白酶分子上的极性基团受到弱酸性环境的影响，处于较为稳定的解离状态，此时蛋白酶与底物结合表现出较高的活性。

表4 培养基组成对蛋白酶活力影响Table 4 Effect of medium composition on protease activity

相对于中性蛋白酶的稳定状态，碱性蛋白酶受pH 值影响波动较大。 在pH 值分别为6.0 和7.0 时，碱性蛋白酶活力分别为（351.2±0.2）U·g-1和（351.5±0.9）U·g-1，显著低于pH 值6.5 和7.5 时酶活力的（375.3±0.3）U·g-1和（408.8±0.4）U·g-1，比pH 值6.0 时酶活力分别提升6.9%和16.4%。中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别在pH 值为6.5和7.5 时达到最高酶活力，但碱性蛋白酶活力低于中性蛋白酶活力。 培养基pH 值的变化对于中性蛋白酶和碱性蛋白酶的影响存差异，在相同pH 值时中性蛋白酶活力高于碱性蛋白酶，说明米曲霉产中性蛋白酶的酸碱耐受性更好。

图8 pH 值对米曲霉中性蛋白酶活力影响Figure 8 Effect of pH on neutral protease activity of A.oryzae

图9 pH 值对米曲霉碱性蛋白酶活力影响Figure 9 Effect of pH on alkaline protease activity of A.oryzae

2.3.3 培养温度对产蛋白酶活力影响 C∶N=4∶1、pH 值为6.5、 恒温培养48h 时， 考察不同温度对酶活力的影响。 由图10 和图11 可知，在不同温度下，米曲霉中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力变化显著。 温度为30°C 时两者酶活力达到最大值[（508.2±0.4）U·g-1]和[（392.4±0.3）U·g-1]。在28°C 时，中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力分别为（430.1±0.3）U·g-1和（380.3±0.4）U·g-1，32°C 时酶活力分别为（450.3±0.3）U·g-1和（385.8±0.3）U·g-1。不同温度对中性蛋白酶和碱性蛋白酶影响趋势相似，但碱性蛋白酶活力均低于中性蛋白酶活力，即使在30°C 时两者酶活力相差115.8U·g-1。 此外，中性蛋白酶在相邻温度下酶活力之差分别为78.1U·g-1和57.9U·g-1，而碱性蛋白酶分别为12.1U·g-1和6.6U·g-1，说明相同温度变化范围内，中性蛋白酶稳定性低于碱性蛋白酶。

3 讨论与结论

麦麸中含有64.5%碳水化合物，是理想的固态发酵培养和产酶培养碳源[25]，而麦麸中主要的碳水化合物为麦芽糖，因此米曲霉在麦芽糖为碳源时表现出良好的生长状态。 KETIPALLY 等[26]优化米曲霉产多聚半乳糖酶条件，以纤维素和麦芽提取物作为碳源和氮源时，获得最高酶活力。本研究麦芽糖与酵母粉比例为4∶1 时，菌株产中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力最高， 其最佳酶活力温度与多聚半乳糖酶相接近。 米曲霉生长量和产酶量在30～35°C 具有最高值[27]，本研究中米曲霉生物量在30°C 达最高值，为（2.10±0.12）g·L-1，此温度下中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力达最大值，分别为（508.2±0.4）U·g-1和（392.4±0.3）U·g-1，与SHAFIQUE 等[28]和DJEKRIFDAKHMOUCHE 等[29]研究结果一致。

图10 培养温度对米曲霉中性蛋白酶活力影响Figure 10 Effect of culture temperature on neutral protease activity of A.oryzae

图11 培养温度对米曲霉碱性蛋白酶活力影响Figure 11 Effect of culture temperature on alkaline protease activity of A.oryzae

蛋白酶作为最重要的水解酶和工业酶类[30]，在全球总酶类销售中占有60%的比例，被应用于医药、食品等行业[31]，具有极高的商业价值[32]。 在传统发酵食品中，蛋白酶能够分解原料中蛋白质，产生风味物质增加食品风味[33]。 米曲霉普遍存在于发酵食品，其蛋白酶研究对于发酵食品制作工艺优化具有重要意义。 米曲霉中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力对奶酪中营养成分和风味的形成十分重要，两者活力的提高对于奶酪品质改良影响显著。研究获得的米曲霉产中性蛋白酶和碱性蛋白酶培养条件，使其活力分别提高69.49%和53.59%，利于米曲霉在霉菌奶酪中的应用。 除蛋白酶研究外，米曲霉其它酶类研究在乳糖分解[34]、木质素催化降解[35]、去除酒糟化学需要量[36]等应用中进展迅速，奠定了米曲霉在食品发酵中的重要地位。

米曲霉培养条件优化，对发酵产品品质研究十分重要[37]，本研究中优势米曲霉作为新型霉菌奶酪发酵剂，最佳培养条件为麦芽糖15.30g·L-1、酵母粉11.60g·L-1、温度30.80°C、pH 值7.0，高产中性蛋白酶和碱性蛋白酶条件分别为pH 值6.5 和pH 值7.5、C∶N=4∶1、温度30°C，为后续霉菌奶酪制作和品质研究提供参考。 米曲霉菌株在传统发酵食品工业中具有长期的安全历史[38-39]，其作为霉菌奶酪新菌种的开发将为国内新型霉菌奶酪研制提供理论依据。