碳化金属-有机骨架强化种间电子传递产甲烷

张海华，董海泉，李慧，袁璐韫，方哲，程军

（1 杭州环境集团有限公司，浙江杭州310022； 2 浙江大学国家清洁能源利用重点实验室，浙江杭州310027）

引 言

生物甲烷是一种可替代化石燃料的绿色可再生能源，通过畜禽粪便、农作物秸秆、废弃食品等多种有机质废弃物厌氧发酵产生[1-3]。厌氧发酵是多种微生物协同生化代谢过程，产乙酸细菌和产甲烷菌之间的电子传递速率决定着整个系统的产甲烷反应速率[4]。在厌氧发酵过程中，氢分子由产乙酸细菌产生，后直接被产甲烷菌利用过程称为种间氢传递（IHT）过程，IHT 是一种以氢气分子为媒介的种间电子传递过程[5-6]。然而，系统中较低的氢分压限制了产乙酸细菌和产甲烷菌之间氢扩散速率，从而限制了生物甲烷的生产[7-8]，所以研究种间电子传递过程是解决生物甲烷产生速率瓶颈的关键。

有研究表明，产乙酸细菌和产甲烷菌之间还存在着直接种间电子传递（DIET）过程，DIET 不是通过氢为电子载体实现的，可以解决系统中氢分压限制的问题[9-15]。对DIET 过程研究主要有以下三方面：①利用纳米导线的DIET作用。纳米导线是一种导电菌毛，由六血红素C型细胞色素OmcS头尾堆叠而成[16]。纳米导线在细胞外电子传递中起重要作用，能将电子转移到三价铁以及其他胞外电子受体中，包括腐殖质[17]。微生物分泌的具有电化学活性的胞外聚合物，其中的腐殖质，如类富里酸具有氧化还原能力，参与胞外到胞内的电子交换过程[1,18]。②利用膜结合电子转运蛋白的DIET 作用。有研究发现，细胞色素c和多血红素细胞色素OmcZ能够参与到DIET 过程[19]。③利用导电材料的DIET 作用。厌氧发酵过程中添加导电材料，如活性炭等碳基材料能够促进甲烷生成[9-10]。研究发现，碳纳米管的加入能够通过改变胞外聚合物（EPS）和膜结合电子转运蛋白来增强种间电子传递过程[13]。

近年来，金属-有机框架MOF 材料由于其大比表面积、多孔性、颗粒大小形状可控等性质备受关注[20-21]。Gargiulo 等[22]研究了铬基MOF 材料用于厌氧发酵沼气的提纯净化，由于MOF 材料的多孔亲和性，能够有效去除H2S等杂质，具有很大的工业运用潜力。有研究通过对不同MOF 材料的导电和催化特性的分析比较，总结了MOF 和金属-有机骨架复合材料在电化学领域的发展方向。然而，MOF 材料用于厌氧发酵促进产甲烷方面鲜有研究[23]。在MOF材料中，ZIF-8是锌沸石咪唑盐框架，碳化后的ZIF-8材料具有良好的导电性和磁性[21]。但是，碳化后的ZIF-8 材料用于厌氧发酵系统中对DIET 的影响机理尚未清楚。因此，本文的主要工作是探究碳化后的ZIF-8材料促进厌氧发酵系统中微生物种间电子传递过程的机理。从产甲烷污泥导电性、细胞色素c 含量和具有电化学活性的胞外聚合物成分变化来分析碳化后ZIF-8材料对DIET作用的影响。

1 实验材料与方法

1.1 材料和接种物

碳化后的ZIF-8 材料（以下简称：ZIF-8 衍生多孔碳）的制备采用如下步骤。①将810 mg 六水合硝酸锌和526 mg 二甲基咪唑分别加入盛有40 ml乙醇的两个烧杯中；②混合两个烧杯中溶液，搅拌均匀，在室温（25℃）条件下，静置12 h左右；③离心收集得到的ZIF-8粉末，用甲醇反复洗涤多次，在真空干燥箱中80℃的条件下干燥；④800℃的氮气氛围中加热3 h 进行碳化处理；⑤用HF（10%）清洗除去粉末中的锌纳米颗粒，得到ZIF-8衍生多孔碳材料。

接种物为厌氧产甲烷污泥，来自于浙江省杭州市环境集团厌氧发酵罐，在(37.0±1.0)℃的条件下，重复富集3 次，每次7 d，得到富含甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷丝菌属（Methanothrix）的混合厌氧产甲烷菌污泥[24]。实验中的富集培养液成分如下[25]：MgCl2·6H2O，0.2 g/L；K2HPO4，0.4 g/L；L-半胱氨酸，0.5 g/L；酵母膏，2 g/L；蛋白胨，2 g/L；氨三乙酸，10 g/L；微量元素液，10 ml/L；维生素液，10 ml/L。

1.2 厌氧发酵实验

实验设置四个实验组和一个对照组。发酵瓶内工作体积为200 ml，包含40 ml培养液、160 g 接种物和0.85 ml的乙醇作为发酵底物，实验组中分别加入0（对照组）、50、100 和200 mg/L 的ZIF-8 衍生多孔碳材料，空白组中无乙醇底物和ZIF-8 衍生多孔碳材料的加入。所有发酵瓶初始pH 调整到8.0 左右，通氮气5 min 左右，连接至AMPTS Ⅱ系统（Bioprocess Control，瑞典）中，发酵温度设定为37℃，每三天取1 ml 发酵液用于液相成分测试。气相数据从AMPTS Ⅱ系统中下载，液相数据从气相色谱仪（GC-FID）分析得到。乙醇发酵实验在AMPTS Ⅱ系统上进行，AMPTS Ⅱ系统如图1 所示，发酵过程中产生的CO2基本被NaOH 溶液完全吸收，实验结果得到气体数据中甲烷体积组分为100%。

图1 AMPTS Ⅱ厌氧发酵系统Fig.1 AMPTS Ⅱanaerobic digestion system

1.3 微生物和ZIF-8衍生多孔碳材料微观表征

场发射扫描电镜（SEM，Hitachi SU-8010，日本）用于观察ZIF-8 衍生多孔碳材料的微观形态以及ZIF-8 衍生多孔碳和产甲烷菌群之间的物理联系。ZIF-8 衍生多孔碳材料的平均粒径通过ImageJ 软件在SEM 图像中选取约200 个颗粒测量统计分析得到。扫描电镜-能量色散光谱（SEM-EDS）用于表征合成ZIF-8 衍生多孔碳材料中的元素组成成分。ZIF-8 衍生多孔碳材料表征分析见附录，ZIF-8衍生多孔碳的平均粒径约为1.76 μm，比表面积为1727 m2/g，孔容积为0.758 cm3/g，孔径为1.076 nm。

1.4 电化学分析

电化学分析用于测试发酵实验中加入ZIF-8衍生多孔碳后厌氧产甲烷污泥的导电性变化。取发酵瓶中的混合污泥样品，8000 r/min离心5 min，沉淀物用0.1 mol/L NaCl 溶液洗涤三次。采用三探针电导率测量污泥导电性，污泥样品置于绝缘间隙中连接两边的金片，导电探针分别接触两金片电极以连通整个电路，电化学工作站施加的电压范围为-1.05～1.05 V，梯度为0.025 V[26]。利用得到的电压电流值拟合得到污泥的电导率，计算公式如下：

式中，σ 表示厌氧产甲烷污泥电导率，S/m；L 表示间隙的宽度,m；R 表示电流伏安曲线中斜率的倒数，Ω；S表示横截面积，m2。

1.5 细胞色素c测试方法

细胞色素c 的浓度定义为微生物中单位质量总蛋白中细胞色素c 的质量。采用SDS-苯酚萃取法从发酵瓶中的混合污泥样品提取蛋白，提取步骤简述如下：细胞破碎（0.25 mol/L 柠檬酸，1% SDS，Tris饱和酚，0.1 mol/L 乙酸铵甲醇溶液），沉淀，溶解（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，2% 3-[(3-氯胺丙基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐，65 mmol/L 二硫代苏糖醇）。提取得到的蛋白利用ELISA 试剂盒（Lanpai Bio，中国）测定细胞色素c浓度[9]。

1.6 三维荧光光谱分析胞外聚合物

三维荧光光谱法用于分析加入ZIF-8衍生多孔碳后产甲烷微生物EPS 的变化情况。EPS 的提取采用改进的加热法[25]。三维荧光光谱仪（Horiba JY Aqualog）设置激发Ex波长范围200～450 nm，增量为5 nm，扫描Em波长范围250～550 nm，增量为5 nm。根据Ex/Em波长的值，可以将三维荧光光谱分为五个区域[27]，每个区域代表EPS 内的一种有机物。各有机物的相对浓度由荧光响应百分比表示[28-29]：

式中，φi代表荧光光谱区域的荧光体积；Δλex代表激发波长间隔（取5 nm）；Δλem代表发射波长间隔（取5 nm）；I(λexλem)代表每个激发发射波长对的荧光强度；φT代表荧光光谱下的累积体积。不同地区的荧光光谱频谱与φT和φi的数值密切相关。

2 实验结果和讨论

2.1 ZIF-8 衍生多孔碳对厌氧发酵产甲烷能力的影响

图2 添加不同浓度ZIF-8衍生多孔碳对甲烷产量及产率的影响Fig.2 Methane yield and production rate with the addition of various concentrations of ZIF-8 derived porous carbon

表1 添加不同浓度ZIF-8衍生多孔碳时利用乙醇发酵产甲烷的动力学参数Table 1 Kinetic parameters of fermentative methane production from ethanol with various concentrations of ZIF-8 derived porous carbon addition

图3 厌氧发酵液相代谢产物分析Fig.3 Analysis of liquid metabolites in anaerobic digestion

在乙醇发酵产甲烷实验中，不同浓度的ZIF-8衍生多孔碳的加入对甲烷产量和产甲烷速率的影响如图2 所示。随着ZIF-8 衍生多孔碳添加量的增加，对应的甲烷产量和产甲烷峰值速率都呈现升高趋势。尤其在加入200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳时，甲烷产量和产甲烷峰值速率达到最大，分别为(569.10±13.99) ml/g 和(31.39±0.52) ml/(g·d)（以乙醇计）。与未添加ZIF-8衍生多孔碳的对照组相比，甲烷产量和产甲烷峰值速率分别增加了18.81%和19.04%。利用Gompertz 公式对甲烷产率进行拟合得到的动力学参数如表1 所示，拟合结果表明随着ZIF-8 衍生多孔碳添加量的增加，对应的甲烷产率和产甲烷峰值速率都明显增加，与实验结果一致。在添加200 mg/L 的ZIF-8 衍生多孔碳时，甲烷产量和产甲烷峰值速率分别达到628.40 ml/g和32.71 ml/(g·d)，相比对照组分别提高了19.3%和12.1%。说明ZIF-8衍生多孔碳的加入在一定程度上强化了发酵产甲烷能力，其强化的原因主要有两点：①ZIF-8衍生多孔碳材料具有较大比表面积，有利于产甲烷微生物附着和富集；②ZIF-8 材料经过碳化后具有导电性，有利于微生物的种间电子传递过程。

图4 厌氧发酵结束后的产甲烷污泥SEM图Fig.4 SEM images of methanogenic sludge after anaerobic digestion

在乙醇厌氧发酵产甲烷过程中，主要包括乙醇酸化和乙酸产甲烷两个过程。由图3(a)看出，在第6天实验组中乙醇被完全消耗，说明乙醇酸化过程已全部结束。在加入不同浓度的ZIF-8 衍生多孔碳后，乙醇的降解速率快于对照组，说明ZIF-8衍生多孔碳促进了乙醇的酸化降解过程。由图3(b)可知，第6天乙酸含量达到最高，后不断降低，这是因为乙醇已全部酸化生成乙酸，而后乙酸被消耗用于产甲烷。添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳实验组中，乙酸含量最高为62.37 mmol/L，是对照组的1.35 倍。6 d后，乙酸消耗速率随着添加ZIF-8衍生多孔碳浓度的增加而加快。通过液相代谢产物中乙醇和乙酸动态含量的分析，表明ZIF-8 衍生纳米多孔碳同时促进乙醇酸化和乙酸产甲烷两个过程。

2.2 微生物表面形态分析

乙醇产甲烷发酵结束后，取添加0 和200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的厌氧产甲烷污泥用于SEM 观察，可以分析ZIF-8 衍生多孔碳和产甲烷微生物之间表面结合情况。如图4(a)所示，在未添加ZIF-8衍生多孔碳的对照组中，可以观察到杆状和球状微生物表面光滑均匀，分布较独立。在加入200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳之后，通过对厌氧产甲烷污泥样本不同位置的观测[图4(b)]，明显观察到球状产甲烷微生物主要聚集在ZIF-8 衍生多孔碳颗粒周围，并且附着在材料表面上。如图4(c)所示，球状产甲烷菌表面还出现了类似于“纳米导线”状的胞外聚合物，使产甲烷菌和ZIF-8 衍生多孔碳之间结合更紧密。SEM 分析结果表明ZIF-8衍生多孔碳对于产甲烷菌起到较好的固定化作用，而且“纳米导线”的大量出现，有利于促进DIET过程。

2.3 厌氧产甲烷污泥的导电性

添加ZIF-8衍生多孔碳有利于提高厌氧产甲烷污泥的导电性。如图5所示，乙醇发酵实验结束后，未添加ZIF-8 衍生多孔碳的对照组污泥电导率为7.93 μS/cm，加入200 mg/L ZIF-8衍生多孔碳后电导率提高了84.6%，为14.64 μS/cm。其中对照组污泥去除EPS 后的系统电导率为1.37 μS/cm，加入200 mg/L ZIF-8衍生多孔碳的实验组去除EPS 后系统电导率为6.28 μS/cm，提高了3.58 倍。以上结果说明加入ZIF-8衍生多孔碳后能够显著提高产甲烷污泥导电性，一方面是由于ZIF-8 衍生多孔碳本身的导电性，另一方面可能是由于外加的ZIF-8 衍生多孔碳通过刺激EPS的成分变化来提高微生物胞外电子传递能力。

图5 厌氧发酵结束后产甲烷污泥电导率Fig.5 Conductivity of methanogenic sludge after anaerobic digestion

细胞色素c 在厌氧发酵产甲烷的过程中起到电子传递作用[19,30-31]。如图6 所示，随着加入ZIF-8 衍生多孔碳浓度的增加，厌氧产甲烷污泥中总蛋白质浓度由0.605 g/L 提高到0.868 g/L（以悬浮污泥计），说明ZIF-8 衍生多孔碳提高了微生物的富集，起到固定化作用。然而，细胞色素c 浓度降低，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的实验组c-Cyt 浓度最低，为0.261 mg/g（以蛋白质计），相比对照组降低了26.1%。这是因为ZIF-8 衍生多孔碳具有良好的导电性，在一定程度上代替了细胞色素c 的电子传递作用。

2.4 ZIF-8衍生多孔碳材料对EPS的影响

图6 乙醇发酵结束后厌氧产甲烷污泥中总蛋白质浓度和细胞色素c 浓度变化Fig.6 Changes of total protein and c-Cyts’concentration in methanogenic sludge after anaerobic digestion

在乙醇发酵产甲烷的过程中，具有氧化还原活性的EPS 的存在有利于微生物胞外电子传递过程，提高产甲烷能力。如图7 所示，三维荧光光谱分析将EPS 中有机物分为五个区域。区域（1）酪氨酸类蛋白和区域（4）可溶性微生物副产物是可生物降解的，区域（2）色氨酸类蛋白、区域（3）类富里酸和区域（5）类胡敏酸不可降解，具有氧化还原能力，能够参与到微生物胞外电子传递过程中[32-34]。表2 中根据三维荧光光谱的计算结果得出，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳的实验组中，区域（1）酪氨酸类蛋白和区域（4）可溶性微生物副产物相对含量均有所下降，区域（3）类富里酸相对含量由18.0%提高到23.6%，说明添加ZIF-8衍生多孔碳提高了微生物的降解能力以及通过类富里酸分子介导的胞外电子传递效率。

2.5 ZIF-8 衍生多孔碳材料强化产甲烷过程机理分析

在乙醇厌氧发酵产甲烷实验中添加ZIF-8 衍生多孔碳后，系统中甲烷产量、最大产甲烷速率、乙醇酸化速率以及乙酸的生成消耗速率均有不同程度的提高。ZIF-8 衍生多孔碳材料强化生物发酵产甲烷过程的机理示意如图8 所示。ZIF-8 衍生多孔碳材料较大的比表面积起到菌群固定化作用，并且促进纳米导线产生。其良好的导电性强化了产乙酸细菌和产甲烷古菌之间的种间电子传递过程，种间电子传递的强化使得CO2和乙酸等代谢加快，从而达到强化乙醇发酵产甲烷的效果。

3 结 论

（1）实验结果表明，ZIF-8 衍生多孔碳强化厌氧发酵产甲烷能力，添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳时，甲烷产量和最大产甲烷速率分别增加了18.81%和19.04%。

（2）厌氧产甲烷污泥的SEM 表明ZIF-8 衍生多孔碳起到菌群固定化作用，并且能促进纳米导线产生。

表2 基于三维荧光光谱图的各荧光区域百分比参数Table 2 Parameters of five fluorescent regions based on the 3D-EEM spectrogram

图7 微生物胞外聚合物三维荧光光谱分析Fig.7 3D-EEM analysis of microbial extracellular polymeric substance

（3）添加200 mg/L ZIF-8 衍生多孔碳时，去除EPS 的系统导电性提高了3.58 倍，而细胞色素c 含量降低了26.1%，说明ZIF-8 衍生多孔碳具有良好的导电性，并且能在一定程度上代替细胞色素c 的电子传递作用。

（4）三维荧光光谱分析表明ZIF-8 衍生多孔碳的加入提高了微生物的降解能力以及通过类富里酸分子介导的胞外电子传递效率。

符 号 说 明

Em——扫描波长，nm

Ex——激发波长，nm

Hm——最大产甲烷潜力，ml/g

I(λexλem)——激发发射波长对的荧光强度

L——间隙的宽度，m

图8 ZIF-8衍生多孔碳材料强化生物甲烷化过程机制示意图Fig.8 The enhanced mechanism of bio-methanation with ZIF-8 derived porous carbon materials

R——电流伏安曲线中斜率的倒数，Ω

Rm——产甲烷峰值速率，ml/(g·d)

S——横截面积，m2

Tm——产甲烷峰值时间，h

λ——产甲烷迟滞时间，h

Δλem——扫描波长间隔，nm

Δλex——激发波长间隔，nm

σ——厌氧产甲烷污泥电导率，S/m

φi——荧光光谱区域的荧光体积

φT——荧光光谱下的累积体积