基于网络药理学对清肺排毒汤中射干-麻黄治疗新型冠状病毒肺炎的机制分析*

曾小艳童丽李永平#

（1青海大学2019级硕士研究生 西宁810016；2青海大学医学院 西宁810099）

2019年12月我国湖北省武汉市报道多例由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-COV-2）感染引起的新型冠状病肺炎（简称新冠肺炎，WHO正式命名为Coronavirus Disease 2019,COVID-19）。在我国抗击新冠肺炎疫情中，中医药发挥了重要作用，国家中医药管理局及国家卫生健康委员会推荐使用清肺排毒汤[1]。射干麻黄汤是清肺排毒汤的重要组成部分，射干麻黄汤在新冠肺炎治疗中发挥了宣降肺气、温肺化饮的作用，对新冠肺炎所致的咳喘发挥了重要作用。射干麻黄汤出自《金匮要略》，射干麻黄汤中射干-麻黄共为君药，射干性味苦、寒，具有化痰止咳的功效；麻黄性味温、辛、微苦，具有发汗解表、宣肺平喘的功效[2]。在临床中，射干与麻黄用于治疗咳喘病症时常配对使用。现代研究发现，射干具有抗氧化、抗炎等药理作用[3]，麻黄具有抗氧化、平喘镇咳等药理作用。本研究对射干-麻黄治疗COVID-19的有效活性成分、作用靶点、作用途径进行分析。现报道如下：

1 分析方法

1.1 射干-麻黄活性成分及靶点筛选 在中药系统药理数据库（TCMSP）中检索射干、麻黄，收集其化学成分以及靶点信息，设定成分筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18，对所有成分进行筛选，筛选出射干、麻黄的活性成分及作用靶点。

1.2 COVID-19靶点筛选 以“Novel Coronavirus”为关键词，在GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传病数据库（OMIM）和美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库中进行检索，筛选出疾病的靶点。

1.3 射干-麻黄治疗COVID-19靶点的筛选 将射干、麻黄和新冠肺炎的靶点分别导入生物信息学与进化基因组学数据库（Bioinformatics&Evolutionary Genomics）中，筛选出射干-麻黄作用于疾病的靶点，用于下面的通路富集分析。

1.4 射干-麻黄治疗COVID-19的蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 将射干-麻黄及COVID-19的共有靶点输入String数据库进行蛋白互作（PPI）网络构建，将PPI网络导入Cystoscap3.7.2中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，以Degree、betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality这四个参数为参考标准，通过Degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，筛选出排名前20的靶点。

1.5 中药-成分-疾病-靶点网络构建 应用Cytoscape3.7.2软件，以纳入的射干-麻黄、对应的活性成分、COVID-19及作用靶点为基础，构建中药-成分-疾病-靶点网络图，以筛选出核心活性成分。

1.6 GO富集分析 将射干-麻黄及COVID-19的共有靶点进行GO的生物过程（Biological Process,BP）、分子功能（Molecular Function,MF）、细胞组分（Cell Component,CC）富集，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，并用R3.6.3绘制柱状图及气泡图。

1.7 KEGG通路富集 将射干-麻黄及COVID-19共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，并筛选排名靠前的20条KEGG通路，应用R3.6.3绘制柱状图及气泡图。

2 结果

2.1 射干-麻黄活性成分及靶点筛选结果 麻黄筛选得到23个有效活性成分和治疗COVID-19的210个靶点；射干筛选获得到17个活性成分和治疗COVID-19的96个靶点。

2.2 COVID-19靶点基因筛选结果 经过检索，在OMIM数据库检索到2个疾病相关基因，在GeneCards数据库检索到350条相关基因，NCBI基因数据库到51个基因，将这3个数据库的基因合并删重之后，得到356个新型冠状病毒肺炎相关基因。

2.3 射干-麻黄治疗COVID-19靶点筛选结果 将射干、麻黄和新冠肺炎的靶点分别导入Bioinformatics和Evolutionary Genomics数据库中，筛选出射干-麻黄作用于疾病的靶点，治疗COVID-19的靶点有48个，用于下面的通路富集分析。同时将射干-麻黄的靶点和疾病的靶点共同输入Venny2.1.0绘制韦恩图。见图1。

图1 射干-麻黄治疗新冠肺炎靶点图

2.4 射干-麻黄治疗COVID-19的蛋白互作网络构建及核心靶点筛选结果 将药物疾病共有靶点输入String数据库进行PPI网络的构建，将PPI网络导入Cystoscap3.7.2中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓 扑 分 析，以Degree、Betweenness centrality、Average shortest path length和Closeness centrality这四个参数为参考标准，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，总共筛选出27个关键靶点，将前20个靶点使用R3.6.3进行图片绘制。见图2、图3。从图2、图3中可以看出，射干-麻黄作用COVID-19的靶点蛋白主要有白细胞介素-6（IL-6）、CASP3、丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶3（MAPK3）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、白细胞介素-10（IL-10）、趋化因子2（CCL2）等蛋白。

图2 射干-麻黄治疗COVID-19的蛋白互作网络图

图3 射干-麻黄治疗COVID-19的前20个靶点蛋白

2.5 中药-成分-疾病-靶点网络构建结果 应用Cytoscape3.7.2软件，以纳入的射干-麻黄、对应的活性成分、COVID-19及作用靶点为基础，构建中药-成分-疾病-靶点网络图。以筛选出核心活性成分（77个节点，266条边）。网络图中疾病及药物成分的Degree值为：COVID-19为48、鼠李素41、异鼠李素29、射干10、麻黄18。网络图中各节点之间相连线路的数目为degree，该值越高说明该活性成分在射干-麻黄中起着越重要的作用，表明射干-麻黄治疗COVID-19的主要活性成分可能为鼠李黄素41、异鼠李素29等。通过对网络图的分析，可以推断出射干-麻黄中的活性成分可作用整个生物网络系统，表明射干-麻黄通过多靶点治疗COVID-19。见图4。

图4 中药-成分-疾病-靶点网络图

2.6 GO富集分析 应用R语言进行GO的生物过程、分子功能、细胞组分富集，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，并绘制柱状图。可以看出，射干-麻黄中的有效成分主要通过对脂多糖反应、细菌源分子反应，细胞对内毒素的反应、细胞对细菌源分子反应等生物过程作用于COVID-19。见图5。

图5 GO富集分析柱状图

2.7 KEGG通路富集 将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，总共富集到150条信号通路，使用R3.6.3进行气泡图绘制。见图6。随着节点由小增大，节点富集到的靶点数量也逐渐增多，P值逐渐减小。从图6中可以看出富集靶点较多的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、利什曼病等通路。

图6 KEGG通路富集柱状图

3 讨论

在我国抗击新冠肺炎疫情中，中医药发挥了重要作用。新冠肺炎归属于中医学“疫病”范畴，又称瘟疫、疫疠，主要致病因素是“湿、毒”，湿毒化为湿热可引起咽喉肿痛、咳嗽、咳痰，针对咳嗽、咳痰、咽痛等症，清肺排毒汤中特意用到了射干、麻黄。

本研究通过筛选麻黄，得到23个有效活性成分和210个靶点，射干筛选获得17个活性成分和96靶点。将两者共有靶点删除去重后，总共筛选出218个药物靶点。其中治疗COVID-19的主要活性成分为鼠李黄素41、异鼠李素29。据研究报道，鼠李黄素具有很好的抗炎作用及抗氧化作用，可以很好地预防肺部炎症[4～6]，异鼠李素可通过抑制细胞炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1的释放而发挥抗炎作用，同时异鼠李素具有调节免疫的作用[7]。

在蛋白互作网络构建及核心靶点筛选中，射干-麻黄作用COVID-19的靶点蛋白主要有IL-6、CASP3、MAPK3等靶点蛋白。Go富集分析中，射干-麻黄治疗COVID-19的生物过程中起关键作用的主要有对脂多糖反应、对细菌源分子反应、细胞对内毒素的反应、细胞对细菌源分子反应等。有研究显示[8～9]，脂多糖可通过活化炎性细胞释放出大量的炎性因子，从而引起肺部的炎症。通过KEGG通路富集可看出，射干-麻黄的靶点蛋白主要通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、利什曼病等信号通路作用于COVID-19；AGEs-RAGE信号通路可通过激活NF-κB促进大量促炎细胞因子（如IL-6、IL-8）等的释放，导致细胞和组织的炎症损伤[10]。

综上所述，射干-麻黄中的鼠李黄素、异鼠李素成分在治疗COVID-19中起主要作用。射干-麻黄治疗COVID-19的主要靶点蛋白是IL-6、CASP3、MAPK3、MAPK8、IL-10、CCL2等。射干-麻黄中的有效成分主要通过对脂多糖反应、对细菌源分子反应，细胞对内毒素的反应、细胞对细菌源分子反应等生物过程作用于COVID-19。射干-麻黄治疗COVID-19的主要信号通路有AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、利什曼病等。说明射干-麻黄治疗COVID-19有多成分、多靶点、多途径的特点。但网络药理学研究具有局限性，还需要后期进行动物实验及从分子层面进行验证，为射干-麻黄的开发利用提供理论基础。