市售灯盏花药材及其提取物HPLC指纹图谱研究

张 洪 武正才 黄春球 谢忠浪 腾利兵 郭 昕

云南植物药业有限公司，云南 昆明 650109

灯盏花为菊科植物短葶飞蓬 [ErigeronBreviscapul(Vent.)Hand- Mass.]的干燥全草[1]，又名灯盏细辛，是云南道地的民族药材。全草具有散寒解表、祛风除湿、活络止痛、消积的功效，临床上多用于治疗脑血栓、脑栓塞、中风等脑血管意外所致的瘫痪症、心绞痛等[2]。灯盏花主要成分为灯盏花乙素，此外还含有黄酮、吡喃酮、倍半萜、咖啡酸酯、酚酸类化合物等多种化学成分[3]。

2015版中国药典以灯盏花乙素的含量作为评价药材质量的指标。然而，仅控制灯盏花乙素的含量并不能反映灯盏花药材或提取物的整体质量。指纹图谱质量控制技术通过全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，能有效的反映中药质量[4]。本实验采用高效液相色谱分析方法对10批市售灯盏花药材和8批自提灯盏花提取物进行系统的指纹图谱研究，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004A和B)”建立灯盏花药材及其提取物对照指纹图谱，对各批次的灯盏花药材及其提取物的指纹图谱相似度进行分析比较。近年来虽然有一些文献对灯盏花药材及其提取物HPLC指纹图谱进行研究[5-6]，但是这些指纹图谱仅仅指认了参照色谱峰的结构。笔者对生产用市售灯盏花药材及灯盏花提取物的HPLC指纹图谱进一步进行研究，标定其中3个指纹峰的结构，研究结果为市售灯盏花药材及其提取物的质量评价提供科学参考依据，为市售灯盏花药材及其提取物提供一种有效的质量控制方法，确保外购灯盏花药材及其提取物相关产品的稳定性和均一性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1260高效液相色谱仪(四元梯度泵，自动恒温进样器，柱温箱，紫外检测器)，超声波清洗仪，中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004A和B)的相关软件。

1.2 材料 乙腈(色谱纯)，醋酸铵(分析纯)，磷酸(分析纯)，超纯水。灯盏花乙素、灯盏花甲素、野黄芩素对照品(云南植物药业有限公司研究院自制)。10批灯盏花药材(云南植物药业有限公司外购)，8批灯盏花提取物(云南植物药业有限公司按2015版《中国药典》一部中灯盏细辛颗粒标准制法提取外购灯盏花所得的提取物)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent zorbax C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈(A)，0.1%的醋酸铵水溶液(磷酸条PH为3)(B)，梯度洗脱比例见表1；检测波长：335 nm；柱温：25℃；进样量：5 μL；流速：1 mL/min。

表1 梯度洗脱系统

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取灯盏花乙素对照品适量，加甲醇超声溶解制成含量为0.140 mg/mL的溶液。精密称取灯盏花甲素对照品适量，加甲醇超声溶解制成含量为0.238 mg/mL 的溶液。精密称取野黄芩素对照品适量，加甲醇超声溶解制成含量为 0.043 mg/mL的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取1 g已粉碎成细粉的灯盏花药材，加入75%甲醇溶液100 mL，超声(200 W,50 Hz)45 min,过滤，滤液用0.45 μm的滤膜过滤，即得灯盏花药材供试品溶液。取灯盏花提取物60 mg置50 mL三角锥形瓶中，精密加入75%的甲醇溶液20 mL，超声振荡(200 W,50 Hz)40 min,用0.45 μm的滤膜过滤，即得灯盏花提取物供试品溶液。

2.3 精密度试验 分别取第6批灯盏花药材和第4批灯盏花提取物供试品溶液，按2.1色谱条件连续进样 6 次，每次5 μL，记录所得到的色谱指纹图谱，考察共有峰的相对保留时间，以灯盏花乙素色谱峰为参照，计算大于总峰面积10%的共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值，结果表明，同一供试品溶液连续进样6次的灯盏花药材和提取物大于总峰面积10%共有峰的相对保留时间 RSD<2%、相对峰面积RSD<3%，表明该方法精密度良好。

2.4 重现性试验 取第6批灯盏花药材和第4批灯盏花提取物，按2.2.2中供试品液制备方法分别制备6份供试品溶液，按2.1的色谱条件依次测定，记录所得到的色谱指纹图谱，考察共有峰的相对保留时间，以灯盏花乙素色谱峰为参照，计算大于总峰面积10%的共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值，结果表明，灯盏花药材和提取物各6份供试品溶液大于总峰面积10%共有峰的相对保留时间RSD<2%、相对峰面积RSD<3%，表明该方法重现性良好。

2.5 稳定性试验 取同一份第6批灯盏花药材和第4批灯盏花提取物供试品溶液，按2.1的色谱条件，分别于不同的时间进样，记录0、2、4、6、8、10、16、24 h所得到的色谱指纹图谱，考察共有峰的相对保留时间，以灯盏花乙素色谱峰为参照，计算大于总峰面积10%的共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值，结果表明，不同时间进样的灯盏花药材和提取物大于总峰面积10%共有峰的相对保留时间 RSD<2%，相对峰面积RSD<3%，表明该方法稳定性良好。

2.6 指纹图谱的建立 将10份灯盏花药材的HPLC的指纹图谱(见图1)和8份灯盏花提取物的HPLC的指纹图谱(见图3)，分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004A)，经软件将指纹图谱自动匹配分析，分别生成灯盏花药材对照指纹图谱(见图2)和灯盏花提取物对照指纹图谱(见图4)。

2.7 共有指纹峰的确定及结构指认

2.7.1 药材共有指纹峰的确定 在灯盏花药材的指纹图谱中确定10个峰作为特征峰(见图2)。通过与对照品对照，确定了灯盏花药材中5号峰为灯盏花乙素，9号峰为灯盏花甲素，选取含量最高且为灯盏花指标性成分的灯盏花乙素5号峰为参照色谱峰。

2.7.2 提取物共有指纹峰的确定 在灯盏花提取物的指纹图谱中确定12个峰作为特征峰(见图4)。通过与对照品对照，确定了灯盏花提取物中5号峰为灯盏花乙素，10号峰为灯盏花甲素，12号峰为野黄芩素，选取含量最高且为灯盏花指标性成分的灯盏花乙素5号峰为参照色谱峰。

2.8 相似度的计算

2.8.1 灯盏花提取物的指纹图谱相似度测定 将10批灯盏花药材液相色谱图与对照指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004B)进行指纹图谱测定(见图1)，并计算相似度，评价灯盏花不同外购批次的质量，计算结果见表2。

表2 10批灯盏花药材相似度表

2.8.2 灯盏花提取物的指纹图谱测定 将8批灯盏花提取物液相色谱图与对照指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004B)进行指纹图谱测定(见图3)，并计算相似度，评价灯盏花提取物不同批次的质量，计算结果见表3。结果表明，10 批灯盏花药材和8批提取物的HPLC图谱和HPLC对照指纹图谱对比的相似度均高于 90%，表明 10 批市售灯盏花药材和8批灯盏花提取物相似性良好，质量较稳定。

表3 8批灯盏花提取物相似度表

3 讨论

本实验采用高效液相色谱法对10批市售灯盏花药材和8批灯盏花提取物进行HPLC指纹图谱研究，并分别确定了灯盏花药材及其提取物中的共有色谱峰，标定了灯盏花药材和及其提取物中3个共有峰的结构，通过方法学的考察，该方法的精密度较高，重复性、稳定性好，可用于市售灯盏花药材及其提取物的HPLC指纹图谱测定，为今后其质量评价提供科学依据。

流动相考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-四氢呋喃-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%的醋酸铵水溶液(磷酸调PH至3)的溶剂系统，结果表明，流动相系统为乙腈-0.1%醋酸铵溶液(磷酸调PH至3)系统梯度洗脱条件下基线平稳，色谱峰分离度好，色谱峰保留时间适宜。

经灯盏花药材与其提取物HPLC对照指纹图谱对比发现，灯盏花提取物对照指纹图谱比灯盏花药材对照指纹图谱增加了7号和12号色谱峰，其中12号峰标定为野黄芩素，其为灯盏花乙素的苷元，灯盏花药材按2015版《中国药典》一部中灯盏细辛颗粒标准制法提取，其提取方法为75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至稠膏状，即得灯盏花提取物，可能该方法提取浓缩时间受热较长，灯盏花乙素少量水解成野黄芩素，其它也有成分降解生成化合物7号峰。

由于生产用市售灯盏花药材来源较广，品质参差不齐，为了科学评价不同批次外购的市售灯盏花药材质量的均一性，本实验所用药材均为生产用灯盏花药材，不同批次均从市场上采购而来，每批次采购量均较大，具有生产用灯盏花药材的代表性。同时对灯盏花进行提取，评价不同批次采购的市售灯盏花药材提取物的均一性，结果表明10批市售灯盏花药材及8批自提灯盏花提取物样品相似性良好，质量稳定。