高效液相色谱法测定烯丙孕素的有关物质*

包汝泼，翁士乔，李开刚

（宁波三生生物科技有限公司，浙江 宁波 315000）

烯丙孕素为三烯21碳甾体类孕激素，属19-睾丸酮系列［1］，是一种口服给药，且有孕激素活性的化合物，和所有甾体类化合物一样，具有脂溶性，能进入靶细胞，结合胞内特异性受体［2］，以类似于天然孕酮的作用来抑制促性腺激素的释放。烯丙孕素是后备母猪同期发情的理想药品［3］，可用于大规模批次化的人工授精［4］。另外，烯丙孕素可显著改善乏情后备母猪繁殖性能，提高其发情率和产仔数，且对后代仔猪的生产性能无影响［5-8］。烯丙孕素的研究与应用已有近40年的历史，目前国内外研究该产品的厂家较多，但未见其有关物质测定方法的公开报道。本研究中建立了一种简单易行、专属性强、灵敏度高的烯丙孕素有关物质检测的高效液相色谱（HPLC）法，有助于烯丙孕素的质量控制研究［9-10］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪［美国安捷伦科技公司，包含二极管阵列检测器（DAD）］；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

烯丙孕素原料药（批号分别为151019，151028），烯丙孕素对照品（批号为151008，纯度为99.4%），杂质A（批号为150701，纯度为99.4%），杂质B（批号为150701，纯度为99.7%），杂质C（批号为150701，纯度为99.8%），结构见图1，均由宁波三生生物科技有限公司合成室制备。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析级，水为超纯水。

图1 烯丙孕素及杂质化学结构式Fig.1 Chem ical structural formula of altrenogest and its impurities

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：GRACEAlltimaC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（60∶40，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：316 nm；进样量：20μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取烯丙孕素原料适量，置50mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释成质量浓度为0.5mg/mL的溶液，即得。

对照品溶液：精密量取供试品溶液1mL，置100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质对照品贮备液：分别取杂质A、杂质B、杂质C对照品约10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释成质量浓度为0.1mg/mL的溶液，即得。

对照品贮备液：取烯丙孕素对照品约10mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释成质量浓度为0.1mg/mL的溶液，即得。

系统适用性溶液：取烯丙孕素原料10mg，精密称定，置20mL容量瓶中，分别精密加入杂质A，B，C对照品贮备液1mL于容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性及专属性试验：取2.2项下供试品溶液、系统适用性溶液及空白溶剂（流动相），按拟订色谱条件进样。结果空白溶剂不干扰检测，烯丙孕素理论板数大于5 000，烯丙孕素与各杂质分离度良好。色谱图见图2。

图2 系统适用性及专属性试验高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram s of system suitability test and specifcity test

破坏性试验［11-12］：1）未破坏，取样品约10 mg，置20mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，备用；2）酸破坏，取样品约10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L盐酸溶液2mL，室温下放置2 h，加碱液调节溶液至中性，用流动相定容，摇匀，备用；3）碱破坏，取样品约10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液2mL，室温下放置2 h，加酸液调节溶液至中性，用流动相定容，摇匀，备用；4）氧破坏，取样品约10mg，置20mL容量瓶中，加30%双氧水5mL，室温下放置2 h，冷却，调节溶液至中性，用流动相定容，摇匀，备用；5）高温破坏，取样品约10mg，置20mL容量瓶中，加水适量，溶解，置100℃水浴中放置12 h，冷却，用流动相定容，摇匀，备用；6）强光破坏，取样品约10mg，置20mL容量瓶中，加水适量，溶解，于光照强度4 500 lx条件下放置10 d，用流动相定容，摇匀。按拟订色谱条件进样测定。结果表明，经热、氧、高温破坏后降解不明显，经酸、光破坏后有降解杂质产生，但与主峰分离度良好。详见图3。

线性关系考察：分别取烯丙孕素、杂质A、杂质B、杂质C、烯丙孕素对照品适量，精密称定，加流动相制成质量浓度为10μg/mL的混合贮备液，精密量取混合贮备液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按拟订色谱条件分别进样20μL测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程，并计算各杂质的校正因子。结果见表1。

表1 烯丙孕素及杂质的线性关系考察结果和检测限Tab.1 Linear relationship and detection lim it of altrenogest and its impurities

图3 破坏性试验高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram s of destructive tests

检测限确定：取2.2项下各溶液，将其稀释至一定浓度，以3倍信噪比（S/N=3）测定。烯丙孕素及各杂质的检测限见表1。

精密度试验：取同一批（批号为151008）对照品6份，精密称定，用流动相溶解并稀释成质量浓度为0.5mg/mL的溶液。采用不同人员（实验员1，2）及设备（Agilent 1260-1型，Agilent 1260-2型）按拟订色谱条件进样测定，以各杂质的测定结果进行计算。结果实验员1采用Agilent 1260-1型HPLC仪所得结果的RSD为0，实验员2采用Agilent1260-2型HPLC仪所得结果的RSD为0.80%，表明方法精密度良好。

稳定性试验：取烯丙孕素原料药（批号为151028）适量，依法制备供试品溶液，置室温。精密量取20μL，分别在0，8，24，30h时按拟订色谱条件进样测定。结果的RSD为0.20%（n=3），表明烯丙孕素供试品溶液在30h内稳定性良好。

加样回收试验：分别精密量取杂质A、杂质B、杂质C对照品贮备液各4，5，6mL，置100mL容量瓶中，加入供试品溶液中，制成含标准物质浓度80%，100%和120%的溶液各3份（共9份），分别进样20μL，按拟订色谱条件进样测定，带入线性方程计算回收率，计算时扣除供试品已有的杂质含量（3.37μg/mL）。结果见表2。

2.4 样品有关物质测定

精密量取2.2项下供试品溶液及对照品溶液各20μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图至保留时间的2倍。结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长选择

分别称取烯丙孕素及杂质A，B，C适量，加流动相溶解并稀释成质量浓度为0.5 mg/mL的溶液，通过DAD检测器进行全波长扫描，发现在316 nm波长处烯丙孕素与各杂质的响应最接近，且杂质A和杂质B的相对响应因子在0.9～1.1间，可不使用校正因子，易于简化方法。并对“专属性试验”项下样品进行检测，于316 nm波长下相较其他波长可检测出更多未知杂质，故选用316 nm作为有关物质检测波长。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

表3 烯丙孕素有关物质检测结果（%）Tab.3 Detection results of related substances of altrenogest（%）

3.2 色谱柱选择

本试验中筛选了不同规格和品牌的C18色谱柱：GRACE Alltima silica C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters XTerra RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），Agelavensil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），GRACE Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Welch Materials XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），OMNIBOND ORCA C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。由于杂质A和烯丙孕素在色谱柱上的色谱行为极接近，而杂质B、杂质C和烯丙孕素的色谱行为差异较大，故重点考察杂质A和烯丙孕素的分离度。经筛选，上述色谱柱杂质A分离度分别为无分离效果，1.36，无分离效果，1.01，1.20，1.73，无分离效果，1.63。故最终确定色谱柱为GRACE Alltima C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。

3.3 流动相选择

本试验中通过流动相组成对比（甲醇和乙腈），发现使用甲醇时，烯丙孕素与各杂质无法有效被洗脱分离，采用乙腈能使各杂质完全分离。通过调整乙腈比例（50%，55%，60%，65%，70%）进行条件优化，结果60%乙腈的分离效果最好，故选择水-乙腈（40∶60，V/V）为流动相。

3.4 耐用性考察

通过对流速、柱温、流动相比例进行微调，考察本方法的耐用性，结果上述条件的调整不影响烯丙孕素的有关物质检测结果，表明该法灵敏度高、分离度好、专属性强、结果准确，适用于烯丙孕素有关物质的检测。