马齿苋多糖对幼年糖尿病大鼠糖脂代谢、肾功能的影响及其作用机制

王成祥，刘玉霞，常绍鸿，邢二庆，谢遂亮

（1.新乡市中心医院儿科，河南 新乡 453000；2.新乡医学院第四临床学院儿科，河南 新乡 453000）

近年来，儿童糖尿病患病人数逐年上升［1］。儿童患者多为1型糖尿病，由于儿童生长发育过程中食物消耗及运动量变化大，1型糖尿病患儿血糖较难控制，且由于发病早、病程长，后期多出现并发症，严重危害患者的生命健康［1］。糖尿病肾病是糖尿病患者死亡主要原因之一，也是终末期肾病的主要病因，如何保护糖尿病患者肾脏功能亦是重要研究课题。已有研究发现，高糖环境能够刺激转化生长因子β1 （trasnforming growth factor β1，TGF-β1）大量分泌，TGF-β1与Smad-3蛋白结合刺激炎症细胞聚集，诱发结缔组织生长因子 （connective tissue growth factor，CTGF）增加，促进糖尿病肾病进展［2］；而抑制TGF-β1/Smad3信号通路能够保护肾功能［3］。

马齿苋是我国常见草本植物，具有清热解毒、止消渴、去肿消炎等作用，主治腹泻、疖痈、皮炎、丹毒、痢疾等疾病［4］。近年来研究发现，马齿苋具有降血糖、降血脂等效果。研究显示，服用马齿苋能够改善糖尿病患者的血糖水平［5］；马齿苋多糖亦能够改善糖尿病大鼠的血糖水平［6］。但马齿苋对幼年糖尿病大鼠影响未见报道。本研究探讨马齿苋多糖对幼年糖尿病大鼠的糖脂代谢、肾功能的影响及其可能的作用机制，旨在为临床儿童糖尿病防治提供新的思路和研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

4周龄雄性SD大鼠63只，SPF级，体质量90～108 g，购自北京维通利华公司。链脲佐菌素 （streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司，HE和PAS染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。TGF-β1、Smad3和CTGF多克隆兔抗购自英国Abcam公司；β-actin多克隆鼠抗、羊抗兔、羊抗鼠二抗购自中杉金桥有限公司；蛋白质定量试剂盒 （Bradford法，P1510）购自北京普利莱基因技术有限公司；ECL化学发光液购自美国Millipore公司。

马齿苋多糖提取见文献［7］，马齿苋全株洗净烘干后粉碎，分别使用石油醚脱脂和95%乙醇回流提取各2次，滤渣干燥后，加入20倍水70 ℃ 250 W超声30 min提取2次，提取液抽滤后置于75%乙醇24 h后过滤，洗涤干燥后得到马齿苋多糖，提取率约为6.5%。

1.2 动物分组及模型建立

63只SD雄性大鼠，喂养7 d适应环境后，测量空腹血糖均为正常值。随机分为对照组 （Con组，n=20，正常饮食），另外43只大鼠高脂饮食4周后，后腹腔一次性注射STZ （60 mg/kg），72 h后测量大鼠尾静脉血糖，血糖＞16.7 mmol/L则表示2型糖尿病大鼠造模成功。3只血糖不达标大鼠淘汰。40只造模成功大鼠随机分为糖尿病模型组 （Mod组）和马齿苋多糖组 （PP组），每组20只。PP组采用马齿苋多糖［200 mg/ （kg· d）］灌胃，Mod组和Con组给予等体积生理盐水灌胃，连续干预6周。

1.3 糖脂代谢、肾功能指标测定

3组大鼠分别在干预6周后剪尾取血，离心留取血清，采用全自动生化仪测甘油三酯 （triglyceride，TG）、总胆固醇 （total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白。计算肾指数 （kidney weight index，KWI），KWI （mg/g）=肾质量/体质量。血糖仪测定大鼠空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG）。

1.4 肾组织HE染色和PAS染色

干预6周后处死3组大鼠，取肾，低温冰冻切片，晾干后先用二甲苯脱脂、苏木素液染色、盐酸乙醇分色、伊红染液染色，再放入梯度浓度乙醇溶液中脱水 （100%、95%、85%、70%、50%乙醇各放置3 min），然后在蒸馏水中浸泡2 min透明，中性树胶封片，显微镜下观察HE染色结果。冰冻切片入蒸馏水浸洗，乙醇固定10 min，置入过碘酸溶液5 min，蒸馏水冲洗，干燥后放入雪夫染液30 min，蒸馏水冲洗后苏木精复染，清洗、透明、封片观察。

1.5 肾组织免疫组化

干预6周后取肾组织，4%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯脱脂，包埋切片，3%过氧水室温20 min孵育，蒸馏水冲洗3次，TGF-β1、Smad3和CTGF一抗室温孵育60 min，PBS漂洗3次后二抗室温孵育30 min，PBS漂洗3次，DAB染色 （15 ℃，10 min），PBS漂洗3次，最后再经苏木素复染，树胶封片后观察。随机选取每只大鼠组织切片3张，每张随机抽取5个视野，用平均光密度值作为统计数值，采用Image J软件统计分析。

1.6 Western blotting检测

大鼠干预6周后灌注固定取肾组织，放置于冰上研磨肾组织，加入蛋白裂解液，4 ℃离心30 min，根据试剂盒说明进行操作，采用Bradford法定量计算。取相同量的样品进行12%凝胶电泳 （SDS-PAGE），转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉过夜，封闭阻断抗体，TGF-β1、Smad3和CTGF多克隆兔抗和β-actin多克隆鼠抗采用0.5%BSA溶液稀释，室温下孵育2 h后TBST洗膜10 min，重复3次；羊抗兔、羊抗鼠二抗采用0.5%BSA溶液稀释，室温下孵育2 h后TBST洗膜 15 min，重复3次，加入ECL试剂，凝胶成像仪观测。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 3组大鼠血脂水平比较

结果显示，与Con组比较，Mod组TG、TC和LDLC水平显著升高，差异有统计学意义 （P＜ 0.01）；与Mod组比较，PP组TG、TC和LDLC水平显著降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.01）。见表1。

表1 3组大鼠血脂水平比较 （mmol/L）Tab.1 Comparison of blood lipid levels among three groups （mmol/L）

2.2 3组大鼠血糖和肾功能比较

结果显示，与Con组比较，Mod组FBG、KWI、尿素氮、肌酐和尿蛋白显著升高，差异有统计学意义 （P＜ 0.01）；与Mod组比较，PP组FBG、KWI、尿素氮、肌酐、尿蛋白显著降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.01）。见表2。

2.3 3组大鼠HE染色及PAS染色结果

HE染色结果显示，Con组肾组织形态正常；Mod组系膜细胞增生，基底膜增厚，肾小管肿胀，管腔狭窄，间质可见大量渗出红细胞；PP组HE染色表现与Mod组相同，但肾组织受损程度明显减轻。见图1。PAS染色主要为糖类着色，Con组PAS染色较淡，未见明显糖原沉积，而Mod组大量糖原在肾单位沉积，PP组PAS染色表现与Mod组相同，但肾组织受损程度明显减轻。见图2。

2.4 3组大鼠免疫组化结果

TGF-β1、Smad3和CTGF是TGF-β1/Smad通路的关键蛋白，主要在胞质表达，免疫组化显示为棕黄色。免疫组化结果显示，与Con组比较，Mod组肾组织TGF-β1、Smad3和CTGF阳性表达明显增高，差异具有统计学意义 （P＜ 0.05）。与Mod组比较，PP组肾组织TGF-β1、Smad3和CTGF阳性表达明显下降，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。见图3、表3。

表2 3组大鼠血糖水平及肾功能比较Tab.2 Comparison of blood glucose level and renal function among three groups

图1 3组大鼠肾组织HE染色结果×400Fig.1 HE staining results of renal tissue among three groups×400

图2 3组大鼠肾组织PAS染色结果×400Fig.2 PAS staining results of renal tissue among three groups×400

图3 各组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3和CTGF阳性表达比较 ×400Fig.3 The positive expressions of TGF-β1，Smad3 and CTGF in renal tissues of rats in each group ×400

表3 3组大鼠TGF-β1、Smad3和CTGF阳性表达及蛋白表达比较Tab.3 Comparison of positive expression and protein expression of TGF-1，Smad3 and CTGF in three groups

2.5 3组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表达比较

Western blotting结果显示，与Con组比较，Mod组、PP组TGF-β1、Smad3和CTGF表达明显增加，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。与Mod组比较，PP组TGF-β1、Smad3和CTGF的表达明显降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。见表3、图4。

图4 3组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表达Fig.4 The protein expression of TGF-β1，Smad3 and CTGF in renal tissues of rats in three groups

3 讨论

马齿苋多糖是马齿苋的主要有效成分，研究发现，马齿苋能够改善糖尿病血糖水平［8-9］；能够通过NF-κB信号通路改善糖尿病肝功能损害［9］。马齿苋种子能够降低糖尿病患者血糖水平和血脂水平［10］，改善动脉粥样硬化［5］；亦能够降低血压［11］。马齿苋提取物能够改善肥胖［12］和高糖诱导的认知功能受损［13］。马齿苋提取物能够降低糖尿病患者血压和糖化血红蛋白水平［14］。本研究结果显示，马齿苋多糖能够降低幼年糖尿病大鼠血糖和血脂水平，与以往研究结果一致。幼年糖尿病大鼠PAS染色可见大量糖原沉积，胞外基质增多，KWI增高，提示肾脏肥大，而马齿笕多糖能够改善幼年糖尿病大鼠肾单位糖类沉积，改善系膜增生及肾脏肥大，降低肌酐、尿素氮、KWI、24 h尿蛋白水平，提示马齿苋多糖能够减轻幼年糖尿病导致肾功能损害，对肾功能有保护作用。

TGF-β1/Smad3信号通路在肾纤维化进程中起关键作用。TGF-β1是肾纤维化起始因子，在高糖环境下大量分泌激活后与Smad-3蛋白结合，刺激炎症细胞聚集，引起级联反应，促进下游CTGF大量分泌，导致肾小管上皮增生，肾脏纤维化进展，最终导致肾功能衰竭［15］。研究显示，早期糖尿病肾病发生发展与TGF-β1/Smad3信号通路上调密切相关［16］，高糖环境能够诱导肾小球上皮细胞TGF-β1高表达［17］，抑制该通路能够保护肾功能，延缓糖尿病肾病进展［3］。本研究结果显示，与Con组比较，Mod组TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表达明显增加 （P＜ 0.05）；而与Mod组比较，PP组能够显著降低TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表达 （P＜ 0.05），提示马齿苋多糖可能通过TGF-β1/Smad3信号通路保护肾功能。

综上所述，马齿苋多糖能够改善幼年糖尿病大鼠的糖脂代谢，降低尿蛋白水平，并且对幼年糖尿病大鼠肾功能起保护作用，其机制可能与TGF-β1/Smad3信号通路有关。