脱钙牙本质基质-丝素蛋白支架对人牙周膜干细胞的成骨分化影响*

杨兴华，张静，林静，李兵，王小娟，孙俊伟

(1.山东省烟台市业达医院口腔科, 烟台 264006；2.山东第一医科大学口腔医学院，泰安 271000；3.滕州市中心人民医院口腔科，滕州 277500)

1 引 言

家蚕丝很早就被就用于临床医学及其研究领域，被用作手术缝合线已有100余年的历史[1]。家蚕丝由丝胶和丝素构成，丝素蛋白是蚕丝主要成份。根据不同使用目的，丝素可被加工成膜状、多孔状、胶体状等。目前常用的丝素蛋白 (silk fibroin，SF )溶解剂有9.3 mol/L LiBr、氯化钙三元溶解体系(摩尔比为CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8)等[2-3]。丝素制备孔隙的方法主要有冷冻法、冷冻干燥法(冻干法)、盐析法、发泡法、有机溶剂挥发法等，其中冻干法操作简单，获得的支架稳定，是常用的方法[4]。支架的孔径、孔隙率和孔壁的厚度可以通过调节温度、浓度、制孔剂来实现[5]。SF支架的应用受压缩强度低，缺乏细胞生长分化因子等因素限制，需与高分子有机物、壳聚糖等材料复合以改善其性能[6]。

牙本质为多孔结构，通过对牙本质脱钙处理，使脱钙牙本质基质(decalcified dentin matrix，DDM)具有诱导成骨的能力，其含有大量有助于细胞生长的蛋白和细胞因子，能诱导干细胞定向分化、趋化、增殖，是天然的细胞外成骨诱导基质材料[7]。DDM颗粒的大小对成骨也有影响，研究发现200～1 000 μm的直径粒度更利于新骨形成，其残留的钙、磷离子可为成骨提供原材料[8-9]。因此，DDM作为临床的骨增量材料常应用于口腔种植。通过对比DDM和Bio-Oss两种材料发现，牙种植区新骨生成量DDM具有与Bio-Oss同样的临床效果，可替代Bio-Oss使用[10]。DDM可以取自体阻生牙或者埋伏牙、异体的健康牙齿，经过冷冻降低其免疫性，具有广泛的应用前景。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作为载体可延长药物半衰期。利用PEG6000与SF交联，可增加材料的压缩强度、拉伸强度和柔韧性[11]。

利用SF多孔、可吸收、通透性、可塑性和生物相容性好及DDM的成骨诱导性强、压缩强度高、结构稳定的优点，本研究构建了DDM-SF可吸收多孔支架，并研究其对牙周干细胞的生长和成骨诱导的影响，以期将来应用于牙周、种植骨量不足的临床治疗。

2 材料和方法

2.1 仪器及材料

细胞计数剂Kit-8，yiyuan，上海；LiBr，20022726，国药集团；红外线光谱仪，Tensor II；扫描电镜，MDI Jade 5.0；BCA试剂盒，Solarbio；ALP一抗( 108337 abcam)、BMP-2一抗( 14933 abcam)、RUNX2一抗(ab23981 Abcam)、I型胶原一抗(abcam)；SD 雄性大鼠，山东大学试验动物中心提供。

2.2 方法

2.2.1SF溶液的制备 将适量桑蚕丝置于0.02 mol/L碳酸钠溶液中，100℃煮1 h，脱胶、冲洗、晾干；丝素放入1 L LiBr(摩尔浓度9.3 M)溶液中，60℃水浴溶解、流水透析48 h，蒸馏水透析24 h，检测SF初始浓度，并将其稀释或浓缩至工作浓度[12]。

2.2.2DDM颗粒的制作 正畸拔除离体牙拔髓后进行脱钙、冲洗、脱脂、清洗、晾干处理，冷冻后碾成100～500 μm的颗粒保存。

2.2.3支架制备及性能测定 将100～500 μm的6%SF颗粒与DDM以体积比7:3混合、湿润，加入试件模具，消灭空腔后滴加(6%SF+1%PEG6000)溶液至液平，-20℃真空冷冻干燥，置于80%冷乙醇浸泡12 h；经去离子水冲洗、冻干、消毒后备用。制备分别用于细胞培养和压缩强度测试的膜状和柱状(直径1 cm，高2 cm)复合支架。支架孔径采用电镜下标尺测量10个不同位点的孔径平均值。采用万用电子力学压缩机压断各组材料试件时的压力平均值测定其压缩强度，并对材料进行特性光谱检测，X-ray diffraction(XRD)和BET比表面积检测。

2.2.4人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，HPDLSC)的分离与培养 采用正畸减数拔牙的年轻患者离体牙齿，1 h内在含双抗的瓶中转移至试验室无菌台内。PBS冲洗3遍后，刮取离体牙中下部牙周膜，冲洗、剪碎，置于培养皿内，37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养[13]，待原代培养的细胞铺满80%皿底时，消化、吹打、传代。取第二代细胞进行细胞表面抗原CD11b、CD29、CD44、CD45、CD90等的流式检测及成脂、成骨分化诱导、成神经元样细胞等干细胞的特性鉴定。

2.2.5细胞毒性检测 实验组为30%DDM(v/v)的DDM-SF支架,对照组为SF支架。无菌条件下，将膜状支架覆盖96孔板底部，第二代HPDLSC以5×105个/mL的密度，每孔20 μL接种于材料上。24 h后PBS清洗每孔，加入含10%cck-8的基础培养基，孵育2 h在酶标仪450 nm处测细胞培养基的吸光度(optical absorbance，OA)值，连续7 d。

2.2.6支架对细胞影响检测 第二代HPDLSC以1×106个/mL接种到含DDM体积比为10%、30%、50%的三组DDM-SF支架上培养，在7、21、35 d时，采用研磨法提取细胞的蛋白，WB测细胞ALP、RUNX2、COL-1、BMP-2变化。扫描电镜(SEM)观察细胞与支架。30%DDM-SF支架复合细胞后植入大鼠皮下颅骨表面，分别于2、4、12、24周取出，固定，脱钙、脱水、包埋、切片、HE染色。

3 结果

3.1 性能指标

脱胶溶解后的SF溶液为淡黄色，且具有一定的粘度。制备的SF溶液初始浓度约3%～6%(m/v)；制备的支架为白色、有韧性的多孔材料。在冻干条件下，测得DDM-SF支架孔径及压缩强度见表1，可知SF材料支架加入牙本质后的压缩强度随牙本质比例的增加逐渐增大，且同等条件下DDM-SF的孔径要小于SF的孔径，材料孔径随着浓度的增加而缩小。

按成组设计多个样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis法)，样本压缩强度经秩和检验,得P=0.0148。P<0.05，各组压缩强度有差异。

表1 DDM-SF复合支架的孔径、压缩强度

3.2 DDM-SF支架红外光谱检测

SF特征峰在3 500 cm-1谱峰为酰胺中NH伸缩振动和—OH伸缩振动，见图1(a)。DDM特征波长1 033 cm-1为磷酸根，1 385 cm-1为碳酸根，3 442.20 cm-1、1 631.92 cm-1含有氮氢键,见图1(b)。PEG特征峰在3 500 cm-1为O—H键，2 885.6 cm-1、1 468 cm-1为O—CH2键，见图1(c)。在DDM-SF支架1 631 cm-1处谱峰为酰胺键中—CN伸缩振动和—NH面内变形振动，氮氢键—CO—NH活泼，C—O键伸缩振动，有共价键形成，见图1(d)。

图1 DDM-SF复合支架的红外光谱

3.3 XRD及BET检测

SF支架结晶度非常低,在22°和40°附近有两个衍射包。DDM-SF支架结晶度比较好，而且存在尖锐的无机盐衍射峰，具有三维有序结构，堆积紧密,但晶体的对称性低。经BET检测，材料的孔隙率达98%，材料的孔隙直径10～160 nm，见图2。

图2 BET检测结果

3.4 HPDLSC的细胞培养、鉴定

使用第二代干细胞经流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90结果呈阳性，见图3Ⅰ(a)—(c)；CD11b、CD45呈阴性，见图3Ⅰ(d)—(e)。贴壁培养的牙周膜组织块在第3 d左右开始爬出成纤维细胞样细胞，以组织块为中心向四周放射状生长，铺满70%～80%底壁时，消化传代。传代后细胞形态呈长梭形、短棒形。HPDLSC成骨诱导后光镜下见钙化结节；茜素红染色为阳性；成脂诱导光镜下胞浆内可见脂滴样物；油红O染色呈粟状红色；成神经元诱导可形成成神经元样细胞；NSE免疫荧光染色呈阳性见图3Ⅱ(a)—(i)。

图3 HPDLSC“干”性鉴定

3.5 两组支架对细胞的活性影响

HPDLSC接种于丝素支架后，cck-8法( 450 nm OA值，n=6)测定细胞活性 ,SF、DDM-SF材料组曲线开始渐渐降低，然后提升缓慢，说明支架初期对细胞有抑制作用，1周左右细胞恢复至正常增殖状态。对两组材料OA值进行F检验，P=0.0042，P<0.05具有显著差异，说明含DDM的支架更易促进细胞增殖，见图4。

图4 两组材料OA数值曲线图

3.6 SF、DDM-SF支架形态及细胞的生长情况

制备供细胞培养用的SF膜形支架和尺寸约1 cm×2 cm的柱形支架。SF支架的HE染色显示各孔相通，孔呈圆形，且HE染色干细胞与支架结合紧密。SEM扫描显示干细胞与6%的SF支架、DDM-SF复合支架结合紧密,细胞状态良好，细胞突触舒展充分，见图5。

图5 支架形态及SEM扫描支架表面细胞

3.7 Westernblot结果

作为成骨分化早期成骨指标，RUNX2、BMP-2等蛋白表达随时间的延长逐渐增强。ALP、Col-1等蛋白有较早表达，可能与细胞和材料有关，ALP在第三周时表达最为充分。10%的DDM含量对成骨细胞影响较弱，30%、50%影响明显，说明支架的DDM含量对成骨蛋白表达有影响，见图6。

图6 DDM-SF支架表面HPDLSC Westernblot检测结果

3.8 体内复合支架切片

HE染色显示，随着时间的延长，支架组织逐渐被吸收。实验组和对照组的吸收时间基本一致，实验组第4周时细胞开始在牙本质表面形成吸收凹陷，到24周时DDM大部分被吸收，呈凹陷状，细胞深入到牙本质内部的凹陷类骨质形成，而对照组细胞增殖缓慢，材料吸收缓慢，24周时仍无硬组织形成，见图7。

图7 SF、DDM-SF植入体内不同时间段HE染色结果

4 讨论

本研究证实在冷冻干燥条件下1%PEG+6%SF与30%DDM(v/v)脱钙牙本质基质制作的丝素蛋白脱钙牙本质复合支架(DDM-SF)成孔良好，且具有良好的成骨诱导性和抗压缩强度。本研究测得DDM-SF支架试件的压缩强度为87.33 MPa，足以维持一定生理外形。通过测量孔径，SEM微观下检测证实，DDM-SF致孔率适中，孔径为100 μm左右。DDM在复合支架中不仅增强压缩强度，还起到细胞诱导因子的作用。培养在DDM-SF支架上的HPDLSC代谢旺盛，30%DDM体积比构建的支架细胞合成的成骨指标COL-1、BMP-2、RUNX2浓度最佳。DDM-SF具有的多孔、生物活性、抗压、可吸收等性能，在组织工程骨和口腔种植骨量不足治疗方面具有广阔前景。随着新技术如静电纺丝技术、3D打印技术、纳米技术的出现，在后续材料制作研究中考虑采用以上技术，以实现对制作均匀孔径的可控性和材料的抗菌性。此外，考虑将新材料与SF进行复合，如与石墨烯材料的复合[14]，以增强材料的拉伸强度，或嫁接生长调控因子等。随着技术发展，后续将对DDM-SF支架的制作工艺进一步优化，以实现对其吸收速度和强度的调控。