枸杞-黄精化学成分分析及颗粒制剂工艺的研究

王结鑫 丁 艳 王 倩 褚海清赵 雨 张立明,2,3*

1.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004；2．宁夏特色中医药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004；3．宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004

枸杞-黄精组方在古方中又称二精方、二精丸，来源于《奇效良方卷之二十一·诸虚门》中，具有补精气作用。枸杞具有滋补肝肾、益精明目的功效，黄精具有补精益气等作用，方中枸杞多糖、总黄酮，黄精多糖、总黄酮均具有抗氧化、调节糖代谢活性，对糖尿病具有一定的预防和治疗作用。本课题组前期研究表明枸杞-黄精配伍使用具有很好的降糖作用，且以枸杞-黄精1∶1比例配伍降糖效果最佳[1]，故本实验拟通过以HPLC方法分析枸杞-黄精中多糖、黄酮类成分，确定枸杞-黄精中抗糖尿病生物活性的成分。以颗粒剂性状、成型率、溶化性、吸湿率为考察指标，对枸杞-黄精颗粒的制剂工艺进行多指标综合优化，为二精方进一步开发利用提供研究基础。

1.仪器与材料

1.1 实验仪器 高效液相色谱仪 (Agilent 1260)；分析天平(梅特勒-托利多)；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电子计重秤(厦门佰伦斯电子科技有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；粉碎机(屹立工贸有限公司)；玻璃干燥器；HH-4水浴锅(上海力辰邦西科技有限公司)。

1.2 实验材料 枸杞(批号：070101，产地：宁夏，购自宁夏明德饮片厂)；黄精(批号：070101，产地：四川，石家庄市柏林药材加工厂)；标准品：D-葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506)；D-甘露糖(中国食品药品检定研究院，批号：140651-201504)；芦丁(中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707)；聚乙烯比咯烷酮K30(MYM生物科技有限公司)；微晶纤维素(北京凤礼精求医药股份有限股份有限公司，批号：K792)；硬脂酸镁(上海麦克林生物有限公司，批号：M813581)；滑石粉(北京凤礼精求医药股份有限股份有限公司，批号：20180326)；甘露醇(上海广诺化学科技有限公司，批号：20180810)。

1.3 实验试剂 乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130128)；三氯甲烷(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20160709)；正丁醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：201340506)；甲醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20151120)；乙腈(色谱纯，美国 Fisher 公司)；甲醇(色谱纯，美国 Fisher 公司)；三氟乙酸(分析纯，上海中秦化学试剂有限公司，批号：20170915)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号：20100729)；娃哈哈水。

2 实验方法

2.1 化学成分分析

2.1.1 HPLC色谱条件 多糖类成分的色谱条件[2-5]：安捷伦XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，磷酸盐缓冲液(pH 6.8 )(A)：乙腈(B)=84：16等度洗脱；流速为1 mL·min-1，检测波长：250 nm，柱温为30 ℃，进样量为 10 μL。

黄酮类成分的色谱条件[6-9]：安捷伦XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈∶水∶冰乙酸=5∶94.5∶0.5(A)和乙腈∶水∶冰乙酸=70∶29.5∶0.5(B)；梯度洗脱条件：0～14 min：100%～86%(A)；14～22 min：86%～84%(A)；22～40 min：84%～70%(A)；40～60 min：70%～100%(A)；流速为1 mL·min-1，检测波长：254 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

2.1.2 供试品溶液制备 将枸杞与黄精分别按照1∶1的比例混合，加入75%的乙醇，70 ℃回流提取1.5 h，过滤，回流提取2次，合并滤液，即得醇提取液[10]。将醇提液浓缩并醇沉(使醇含量达到80%左右)，静置过夜，过滤，沉淀用80%乙醇润洗多次，干燥后得到粗多糖，将粗多糖加水溶解，加入氯仿-正丁醇(4∶1)混合溶液脱蛋白，剧烈振荡后3000 r/min 离心10 min，得上清液，在上清液中加入无水乙醇(使醇含量达80%左右)，静置过夜后过滤，所得沉淀依次用 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干得精制多糖[11]。取药物多糖10 mg，精密称定置试管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解密封，于100 ℃ 烘箱中水解8 h，吹干，残渣加甲醇1 mL，使溶解,吹干，重复3次，加水 2 mL使溶解，即得药物多糖水解液。在水解液中加 1.2 mL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 甲醇溶液，1 mL 0.3 mol·L-1的氢氧化钠溶液，混匀，置70 ℃ 水浴加热 30 min，取出，冷却至室温，加0.3 mol·L-1盐酸溶液调节pH至中性，混匀，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层，针筒式微孔滤膜过滤，滤液作为多糖的供试品溶液[3-5]。

将枸杞与黄精提取，石油醚脱脂，残渣加入80%乙醇，60 ℃超声两次，每次30 min，滤过，合并滤液，减压浓缩，浓缩液经HPD-600型大孔树脂，蒸馏水除去水溶性杂质后，50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，针筒式微孔滤膜过滤，滤液作为黄酮的供试品溶液[12-13]。

2.1.3 标准品溶液制备 精密称取葡萄糖、甘露糖分别置于试管中，分别加入5 mL 0.3 mol·L-1的NaOH溶液，振荡溶解，取溶解后的溶液100 μL，加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液50 μL，70 ℃水浴中反应30 min后冷却至室温，加0.3 mol·L-1的盐酸100 μL中和，混匀，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层，针筒式微孔滤膜过滤，滤液作为多糖类成分对照品溶液。

精密称取芦丁，置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至10 mL。色谱分析时，对照品溶液过针筒式微孔滤膜，续滤液即为黄酮类成分对照品溶液。

2.2 干膏粉的制备[14]将枸杞-黄精(1∶1)药材进行粉碎，过20目筛。将药粉回流提取3次，每次1 h，料液比均为1∶10，过滤，合并3次滤液，滤液减压浓缩至一定浓度，加入4%微晶纤维素(MCC)混匀，置于烘箱中烘干后进行粉碎，过5号筛，得干膏粉。

2.3 制剂工艺参数考察 采用湿法制粒法。在湿法制粒中，填充剂和黏合剂对颗粒质量有较大影响，故以制粒情况(捏之成团，触之即散)、成型率、吸湿率、溶化性为参考指标，选择辅料，对制粒工艺进行考察。

2.3.1 填充剂 将微晶纤维素作为填充剂，以制粒情况、成型率、吸湿率和溶化性为指标筛选干膏粉与微晶纤维素最佳比例。

2.3.2 润湿剂的选择 本实验分别以纯化水、乙醇水溶液(70%)、3% PVP K30 醇溶液(70% ) 为润湿剂制粒，以制粒情况和颗粒成型率为指标筛选润湿剂。

2.3.3 润湿剂中乙醇浓度的考察 本实验按干膏粉和辅料的量加入40%的不同浓度乙醇(60%、70%、80%)配置的3%PVP K30 醇溶液，揉捏后快速过筛制粒，将湿颗粒于60℃干燥后整粒。以制粒情况、颗粒成型率为评价指标。

2.3.4 润湿剂用量的考察 按药粉与微晶纤维素2∶1称取3份混合药粉，按总量10%、20%、30%的量添加润湿剂，揉捏后快速过筛制粒，所得湿颗粒于60℃烘干后整粒。以制粒情况、颗粒成型率为评价指标。

2.4 颗粒处方优化 根据上述实验制粒情况，发现在制粒过程中，软材略黏筛，影响颗粒的成型率；枸杞与黄精中含有大量多糖类成分，且多糖类成分易吸湿。因此，对颗粒方进行优化，添加抗黏性与抗吸湿性辅料，从而提高颗粒成型率，改善颗粒稳定性。

2.4.1 抗黏性辅料筛选[15]颗粒的黏性较强，故需加入抗黏性辅料以改善其黏性，从而提高颗粒质量。在处方工艺初步筛选的基础上，固定微晶纤维素用量，选择滑石粉、硬脂酸镁为抗黏性辅料，设计正交实验表；以成型率、吸湿率、溶化性为指标，筛选抗黏性辅料。

取适量干膏粉，按照表1的设计方案，将原料与辅料混合均匀制备颗粒，分别测定颗粒成型率、吸湿率、溶化性，计算综合评分。

综合评分=(最小吸湿率值/吸湿率值) ×50 + (成型率值/最大成型率值) ×50。

表1 抗黏性辅料正交实验设计因素水平

2.4.2 抗吸湿性辅料的筛选[16-17]颗粒的吸湿性较强，故需加入抗吸湿性辅料以改善其吸湿性，从而提高颗粒质量。在处方工艺初步筛选的基础上，固定微晶纤维素用量，选择甘露醇、硫酸钙为抗吸湿性辅料，以成型率、吸湿率、溶化性为指标，设计正交实验，具体见表2，筛选抗吸湿性辅料。

取适量干膏粉，按照下方表2的设计方案，将原料与辅料混合均匀制备颗粒，分别测定颗粒成型率、吸湿率、溶化性，计算综合评分。

综合评分=(最小吸湿率值/吸湿率值) ×50 + (成型率值/最大成型率值) ×50。

表2 抗吸湿性辅料正交实验设计因素水平

2.5 检查 照《中国药典(2015版，第四部)》中有关颗粒剂质量评价规定，对所得枸杞-黄精颗粒进行水分、粒度、装量差异、溶化性进行检查[18]。

3 实验结果

3.1 化学成分分析

3.1.1 枸杞-黄精中多糖类化学成分分析 根据“2.1.2”项下“供试品溶液制备”制备枸杞-黄精的多糖类成分供试品溶液，进行HPLC检测，以“2.1.3”项下“标准品溶液制备”葡萄糖、甘露糖的标准品溶液，进行HPLC检测，按照“2.1.1”项下的色谱条件进行HPLC检测。认为供试品溶液中具有相同保留时间的色谱峰为共有峰。精密吸取供试品溶液10 μL，注入HPLC色谱仪，记录HPLC色谱图，生成枸杞-黄精多糖、葡萄糖、甘露糖图谱，S1-S3分别代表枸杞-黄精(1∶1)多糖、葡萄糖、甘露糖。比较供试品多糖类成分与标准品蒲萄萄、甘露糖图谱，发现多糖类成分中含有葡萄糖、甘露糖。如图1所示。

图1 枸杞-黄精多糖类成分、标准品葡萄糖、标准品甘露糖HPLC谱图

3.1.2 中黄酮类化学成分分析 根据“2.1.2”项下“供试品溶液制备”制备枸杞-黄精的黄酮类成分供试品溶液，进行HPLC检测，以“2.1.3”项下“标准品溶液制备”芦丁的标准品溶液，进行HPLC检测，按照“2.1.1”项下的色谱条件进行HPLC检测。认为供试品溶液中具有相同保留时间的色谱峰为共有峰。精密吸取供试品溶液10μL，注入HPLC色谱仪，记录HPLC色谱图，生成枸杞-黄精黄酮类成分、标准品芦丁图谱。比较供试品黄酮类成分及标准品芦丁谱图，可以确定供试品黄酮中含有芦丁。如图2所示。

图2 枸杞-黄精黄酮类成分HPLC谱图

图3 标准品芦丁HPLC谱图

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察 以“2.1.3项下”的“标准品溶液制备”方法制备的标准品溶液，精密吸取标准品溶液，用溶解试剂稀释并在容量瓶中定容。葡萄糖标准品的浓度分别为0.17 mg/mL、0.84 mg/mL、1.67 mg/mL、2.51 mg/mL、3.34 mg/mL、4.18 mg/mL；甘露糖标准品的浓度分别为0.19 mg/mL、0.95 mg/mL、1.90 mg/mL、2.85 mg/mL、3.80 mg/mL、4.75 mg/mL；芦丁标准品的浓度为0.16 mg/mL、0.32 mg/mL、1.60 mg/mL、3.20 mg/mL、4.80 mg/mL、6.40 mg/mL、8.00 mg/mL。将各个浓度的标准品溶液分别进样。上述各溶液在选定的色谱条件下经HPLC测定后，绘制标准曲线。线性回归方程、R2及线性范围见表3，结果显示标准曲线线性相关系数在0.9996～1.0000 ，表明方法线性关系良好。

表3 各成分检测波长、线性方程、相关系数、线性范围结果

3.2.2 精密度实验 取枸杞-黄精多糖类成分、黄酮类成分供试品溶液分别连续进样6次，记录HPLC色谱图，结果见表4。葡萄糖、甘露糖、芦丁对应的色谱峰峰面积(A)的RSD在2.01%～2.72%，保留时间(T)RSD在0.48%～3.36%，符合特征图谱要求，表明仪器精密度良好。

表4 各成分精密度、稳定性、重复性实验测定结果

3.2.3 稳定性实验 取枸杞-黄精多糖类成分样品、黄酮类成分供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h分别进样，记录HPLC色谱图，结果见表4。葡萄糖、甘露糖、芦丁对应的色谱峰峰面积(A)的RSD在1.07%～2.95%，保留时间(T)RSD在0.04%～2.96%，符合特征图谱要求，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.2.4 重复性实验 取枸杞-黄精多糖类成分样品、黄酮类成分样品，分别平行制备多糖类成分供试品、黄酮类成分供试品溶液6份，分别进样，记录HPLC色谱图，结果见表4。葡萄糖、甘露糖、芦丁对应的色谱峰峰面积(A)的RSD在0.01%～3.06%，保留时间(T)RSD在0.0004%～0.98%，符合特征图谱要求，表明方法的重复性良好。

3.2.5 加样回收率实验 精密吸取已测定的供试品溶液1.0 mL，置于进样瓶中，精密吸取“2.1.1”项下标准品溶液1.0 mL，摇匀，平行制备6份，根据加入标准品的量与测得量计算加样回收率，结果见表4。加样回收率为93.07%～105.11%，RSD为0.009%～0.68%，说明该方法的准确度良好。

3.3 干膏粉与填充剂比例筛选结果 由表5可知，干膏粉与MCC比例为2∶1时成型率最高，故选取干膏粉与微晶纤维素最佳比例为2∶1。

表5 干膏粉与填充剂比例筛选结果

3.4 润湿剂筛选结果 由表6可知，干膏粉与MCC比例为2∶1时，润湿剂为3% PVP K30 醇溶液(70%) 成型率最高，故以3% PVP K30 醇溶液(70%)为润湿剂。

3.5 润湿剂中乙醇浓度筛选结果 由表7可知，干膏粉与MCC比例为2∶1时，润湿剂中乙醇浓度为70% 时成型率最高，故以3% PVP K30 醇溶液(70%)为润湿剂。

表6 润湿剂筛选结果

表7 润湿剂中乙醇浓度筛选结果

3.6 润湿剂用量筛选结果 由表8可知，当干膏粉与MCC比例为2∶1时，润湿剂为3% PVP K30 醇溶液(70%)，用量为40% 时成型率最高，故以3% PVP K30 醇溶液(70%)，用量为40% 为颗粒润湿剂。

3.7 抗黏性辅料正交实验结果 由表9、表10可知，各因素影响程度依次为 C > B > A，最优工艺为A1B3C2 ，即在原处方(干膏粉与微晶纤维素比例2∶1)基础上，滑石粉用量1%，硬脂酸镁用量0.75%，润湿剂乙醇浓度为70%。

表8 润湿剂用量筛选结果

3.8 抗吸湿性辅料筛选结果 由表11、表12可知，各因素影响程度依次为 C > B > A，最优工艺为A3B2C2 ，即在原处方(干膏粉与微晶纤维素比例2∶1，滑石粉用量1%，硬脂酸镁用量0.75%)基础上，甘露醇用量9%，硫酸钙用量6%，润湿剂乙醇浓度为70%。

3.9 检查项下结果 由表13可知，水分小于8%，装量差异在±5%内，粒度和溶化性均符合规定。

表9 抗黏性辅料L9(33)正交实验结果

表10 方差分析

表11 抗吸湿性辅料L9(33)正交实验结果

表12 方差分析

表13 水分、粒度、装量差异、溶化性检查结果

4 结论与讨论

枸杞是宁夏道地药材，最早将其作为药用部位记录在《名医别录》[19]，其功效是滋补肝肾、益精明目。枸杞中具有多种成分如枸杞多糖、枸杞色素、黄酮类化合物、生物碱等，其中大量研究表明枸杞多糖利用价值相对较高[20]。黄精是运用历史悠久的药食同源药物[21]，其具有补气养阴，健脾润肺的功效。本课题组在前期研究中发现，枸杞-黄精多糖提取物对Ⅱ型糖尿病具有降糖作用[1]，因此在此次研究中测定了枸杞-黄精中多糖、黄酮类的成分，通过与标准品对比发现，活性成分有葡萄糖、甘露糖以及芦丁。但通过比较标准品与供试品溶液HPLC峰发现，仍有较多峰未确定其成分，后期还需继续对其成分进行深入分析。枸杞-黄精颗粒的制备工艺采用正交设计等方法，对湿法制粒工艺进行考察和优化，筛选出适合枸杞-黄精组方颗粒的制粒工艺，为制剂质量评价及有效期的确定提供可靠的依据。

中药颗粒制剂主要是在汤剂和糖浆剂的基础上发展的中药剂型，相对于传统汤剂来说，具有方便服用、便于携带、易于调配、剂量准确等优点；而相对于片剂来说，颗粒剂的溶解时间短、药物溶出迅速、患者吸收快、患者生物利用度高等优点。本研究采用湿法制粒，该方法在国内应用较早，是一种传统的制粒方法。笔者在大量文献的基础上对枸杞-黄精颗粒的最优成型工艺进行探索，得出其最佳制备工艺为：干膏粉与微晶纤维素比例为2∶1，滑石粉用量1%，硬脂酸镁用量0.75%，甘露醇用量9%，硫酸钙用量6%，润湿剂为3% PVP K30醇溶液(70%)，用量为40%。通过对颗粒剂的有关检查，均符合规定，证明该制备工艺稳定可行。