肢伤愈合剂中川芎、赤芍的薄层色谱探析

马梦黎 文金隆 庄 彦

云南省玉溪市中医医院，云南 玉溪 653100

肢伤愈合剂(肢伤1号合剂)是玉溪市中医院在肢伤1号方的基础上自主研发的新制剂，由川芎、赤芍等7味中药组成，具有行气活血、祛瘀止痛的功效，用于气滞血瘀型骨折创伤早期。肢伤1号方是在经方“四物汤”的基础上，结合骨折创作早期的病理特点，经临床实践加减化裁而来。处方分析全方主药为川芎、赤芍。川芎活血行气，祛风止痛，是血中气药；赤芍清热凉血、散瘀止痛，善散邪行血。现代药理研究表明川芎中的阿魏酸是公认的活性成分，具有抗肿瘤、抗菌和舒张血管的作用，在很多制剂中作为质量标准的考察指标。赤芍抗炎的化学成分及作用机制研究主要集中在芍药苷。为了更好地对该制剂进行质量控制，保证临床用药安全有效，本研究对其中的川芎、赤芍进行薄层色谱鉴别研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 YXQ-28OSI手提式压力蒸汽灭菌器(嘉兴市中并报医疗仪器有限公司)；KH-50B型超声波清洗器(昆山和创超声仪器有限公司)；BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂)；HH-S2电热恒温水浴锅；ZBY149-83型电热恒温鼓风干燥箱；Canon PowerShot G15数码照相机(Canon INC)；

1.2 材料 硅胶G板(MERCK、青岛海洋化工、自制板)；试剂均为分析纯。阿魏酸对照品(批号：110773-201012)、芍药苷对照品(批号：11C736-201438)、川芎对照药材(批号：120918-201411)、当归对照药材(批号：120927-201516)、赤芍对照药材(批号：121092-201003)等均购自中国药品生物制品检定所，肢伤愈合剂(批号：20150807、20151016、20160526)由玉溪市中医医院制剂室生产。

2 方法与结果

2.1 川芎的薄层鉴别 取本品50 mL，加乙醚振摇提取2次，每次25 mL，合并乙醚液，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取川芎对照药材1 g，加水煎煮2次，每次50 mL，煮沸，并保持微沸20 min，脱脂棉滤过，合并滤液，滤液同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无此斑点。结果见图1。

2.2 赤芍的薄层鉴别 取本品50 mL，加入25 mL经水饱和的正丁醇振摇提取，分取正丁醇层，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解(必要时加中性氧化铝1 g，搅拌，蒸至近干，残渣用乙醇20 mL分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解)，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图2、图3。

图1 川芎TLC鉴别图 图2 赤芍TLC鉴别图(阴性对照) 图3 赤芍TLC鉴别图(药材对照)

3 讨论

3.1 实验优化 本实验初期逐一对该制剂中的主要药味进行提取对照，并制作了相应的阴性对照液一起实验。综合制剂的药理作用和现代有效成份的研究，选择主药的主要药理成分阿魏酸和芍药苷作为最终对照。在实验操作中对以下项目进行优化。

3.1.1 供试品溶液的提取和前处理对比 阿魏酸项采用酸性条件下乙醚萃取、乙醚直接萃取作比较，结果酸性条件下的乙醚萃取液在薄层色谱法中有一明显灰色干扰斑点，与阿魏酸对照品的位置较接近。而乙醚直接萃取既减少操作，又可得到较好地结果。芍药苷项采用醇提不能清晰地分离出来，改用正丁醇提取基本可以分离出来。但在某些批次的产品提取后所得供试液较浓，干扰大。加入中性氧化铝处理后可得到较好结果。

3.1.2 展开系统优化 阿魏酸展开剂分别尝试正己烷-乙酸乙酯(4∶1)(9∶1)、环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酸-甲酸(4∶1∶1∶0.1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.1)(2∶1.5∶0.05)等多种展开剂进行展开对比，根据展开显色效果最终确定展开剂甲苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.1)为展开剂。芍药苷项薄层试验的展开经验，分别尝试用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)多次进行展开对比。在实际工作中，因浓氯试液在贮存过程因贮存时间、环境等原由，会导致浓氨试液的浓度下降导致影响结果。最终决定选择后者作为展开剂。

3.1.3 检视方法选择 阿魏酸分别尝试直接观察、紫外观察、显色剂显色观察对所得的薄层板进行检视。最为方便的是紫外灯下检视，故最终确定为紫外365 nm检视。芍药苷项分别尝试5%香草醛硫酸液、10%硫酸乙醇液、5%硫酸乙醇液显色。5%香草醛硫酸液需要现配现用，10%硫酸乙醇液对雾化器的要求较高。结合我院制剂实验室的条件，最终选择5%硫酸乙醇液。加热显色时选择105 ℃烤箱加热、电吹风热风逐步加热作对比。105 ℃烤箱加热掌握不好时间，容易加热过导致显色斑点效果不好，不能看到斑点显色变化。热风吹则可人为控制加热程度，更好更明显地看到斑点的显现及变化情况。

3.1.4 对照物质的选用 选用相应的对照药材、对照品进行对照。川芎项阴性对照中阿魏酸对照品对应的位置显相同颜色的对照斑点，所以保留了对照药材与对照品两项对照。赤芍项阴性无干扰，为方便实际生产检验控制，最终标准确定为芍药苷项，不再保留赤芍对照药材。

3.2 实验验证 在实际的质量标准应用中，产品批次、实验条件、实验器材、实验人等均是标准应用的主要影响因素，为使所确定的专属性薄层项在实际的应用质控时能较好地指控产品质量。选择不同产品批次、不同薄层板、不同的操作者对该质量标准进行验证。

3.2.1 薄层板验证 不同薄层板对实验的承载量等均有所不同，分离效果亦不相同，所以根据验证结果对质量标准进行点样量的范围界定。对比三种薄层板，Merck板的分离度最高，承载量最小，青岛板次之。自制板分离度最低，承载量最大，需要加大点样量方可得到满意的结果图。故而在点样量中取一个中间点样量。

3.2.2 斑点显色情况 斑点显色与薄层板、显色时间、加热程度及放置时间等息息相关。一般初期的斑点颜色偏艳，放置空气中较长时间后变淡。

综上，通过实验项目的优化与验证，本文建立的肢伤愈合剂的川芎、赤芍的薄层鉴别项色谱斑点清晰，专属性强，阴性对照无干扰。实际应用中简单方便，重复性好，可作为肢伤愈合剂的定性鉴别。曾尝试用高效液相对其阿魏酸和芍药苷进行含量测定，因现实条件等问题暂不定为该制剂的质量标准项。可在以后的标准提升中再进一步确定。