新疆褐牛瘦素基因第2外显子多态性与肉品质性状的相关性

孙亚伟，加依娜古丽·吐尔逊拜，张永鹏，闫向民，李宏波，王金泉，姚 刚，张 杨

(1.新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院 畜牧研究所，乌鲁木齐 830011)

新疆褐牛是中国利用优秀遗传资源结合特殊的自然地理条件，以瑞士褐牛和含有瑞士褐牛血统的阿拉塔乌牛与新疆本地哈萨克牛进行长期杂交选育的肉乳兼用型牛，其群体具备适应性强、耐粗饲、生长发育速度快和产肉性能高等优良特性。目前，这一品种及其杂种牛的数量已占全疆牛数的70%左右。与其他品种或其杂种后代相比，它更适宜于在新疆山区、牧区、半牧区和农区养殖。但这些地方品种牛的肉品质与优质高档牛肉相比还存在一定差距，研究其肉品质相关经济性状，挖掘地方品种潜在的遗传资源优势，对改良地方肉牛品种、促进地区肉牛产业的发展具有重要意义。

1950年Ingalls等[1]研究发现瘦素基因(Leptin)。瘦素是由Leptin基因编码的蛋白质激素，主要由脂肪细胞合成和分泌，作用于动物体中枢和外周组织，具有调节动物采食、调控机体能量代谢和脂肪代谢的作用[2]。牛的Leptin基因定位于4号染色体上[3]，包括2个内含子和3个外显子，但只有第2、3外显子编码氨基酸，成熟的瘦素蛋白由146个氨基酸组成[4]。国内外有关牛Leptin基因的研究报道大多集中在血液瘦素水平[5-7]，以及Leptin基因与体脂含量[8-9]、采食量、产奶量[10-11]和繁殖性状[12-13]的相关性等方面。近几年，大量研究已经证实Leptin基因会对肌肉脂肪含量和嫩度等肉质性状产生影响。Fitzsimmons等[14]以海福特、安格斯、夏洛来和西门塔尔牛为对象，发现Leptin基因3′端存在SNPs，且与牛肉脂肪沉积存在相关关系；Buchanan等[15]发现Leptin基因C73T位点突变与成牛胴体脂肪沉积有关；Schenkel等[16]研究杂交肉牛Leptin基因的结果表明，第2外显子E2JW和E2FB位点与脂肪和瘦肉含量有关，且在肌肉嫩度性状上存在互作效应；目前关于新疆褐牛生长性状研究较多，关于Leptin基因与肉品质研究较少，且群体数量较少，未见报道。本研究将Leptin基因作为研究牛肉品质等性状的候选基因，以新疆褐牛群体为研究对象，利用PCR-RFLP方法检测新疆褐牛群体中Leptin基因第2外显子序列的多态性，并分析其与肉质性状的相关关系，为进一步生产优质高档牛肉提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源及基因组DNA提取

样品采自新疆伊犁西天山农牧发展有限责任公司，选取268头18月龄左右、健康且体况相近的褐牛，在相同的营养水平和管理条件下育肥。其中30头用于脂肪及脂肪酸、氨基酸、肌苷酸、羟脯胺酸的含量测定。屠宰后在第12～13肋骨间采集背最长肌500 g左右，冷冻保存。每头牛颈静脉采血6～8 mL，加入1 mL ACD抗凝， -20 ℃保存。采用常规酚/氯仿提取法提取血液基因组DNA。

1.2 引物设计与PCR反应体系

根据EMBL(AY138588、AJ512638)[17]已经发表的牛Leptin基因外显子2 E2JW、E2FB位点序列，应用Oligo软件设计引物，并引入限制性内切酶CIaI和Kpn2I酶切位点(下划线为酶切位点)，引物分别为上游：5′-CAGGGGAGTGCCTTTCATTA-3′，下游：5′-CTTGATGAG- GGTTTTGGTGTC-3′，上游：5′-CAGGGGAGTGCCTTTCATTA-3′，下游：5′-TGGTGTCAT- CCTGGACCTTCC-3′，扩增片段长度分别为320和94 bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为25 μL：其中PremixTaq12.5 μL(1.25 U)，DNA模版1 μL(50 ng/μL)，上下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，去离子水10.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR产物检测及PCR-RFLP检测

PCR产物采用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。取5 μL PCR-RFLP产物，采用10%丙烯酰胺凝胶(Acr∶Scr=29∶1)进行检测，300 V预电泳10 min，160 V电泳2.5 h，结束后银染，判定基因型。

1.4 脂肪酸、氨基酸、肌苷酸、羟脯胺酸的含量及剪切力测定

氨基酸测定按照GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定方法[18]；脂肪酸测定按照GB/T 22110-2008食品中脂肪及脂肪酸的测定方法[19]；肌苷酸测定参照Aliani等[20]的方法；羟脯氨酸测定按照GB/T 9695.23-2008肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定方法[21]；剪切力测定按照NY/T 1180-2006的剪切力测定法[22]。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件对Leptin基因多态性位点在新疆褐牛群体中的基因型分布进行卡方检验，并对不同基因型与肉品质性状间的关联性进行分析。采用固定模型：Yij=u+Gi+Eij式中，Yij为个体表型记录，u为群体均值，Gi为标记基因型效应，Eij为随机误差；分析基因型效应对肉品质性状的影响。利用Popgene 32和PIC_CALC version 0.6软件，计算等位基因频率、基因型频率、哈达温伯格(Hardy-Weinberg)平衡检验χ2(HWE)、群体杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)[23-25]。

2 结果与分析

2.1 新疆褐牛Leptin基因外显子2 PCR扩增产物和PCR-RFLP结果

新疆褐牛Leptin基因外显子2 E2JW和E2FB位点PCR产物，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图1和图2，扩增片段长度分别为320 bp和94 bp，扩增条带明亮清晰，可用于PCR-RFLP分析。

新疆褐牛Leptin基因外显子 2 E2JW位点用ClaI内切酶对扩增产物进行酶切，10%丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见图3，出现3种带型，AA型320 bp、AT型为320/233/87 bp、TT型为233/87 bp。E2FB位点Kpn2Ⅰ酶切结果见图4，出现2种带型，即CT 型为94/75/19 bp、TT型为94 bp、缺乏CC基因型。

2.2 Leptin基因遗传多态性分析

根据PCR-RFLP电泳图谱进行基因分型，并计算各基因型频率和等位基因频率(表1)。结果显示：新疆褐牛Leptin基因第2 外显子E2JW位点的AA基因型频率为0.784，AT基因型频率为0.187，TT基因型频率为0.030，A等位基因频率为0.877，T等位基因频率为0.123，A基因为优势等位基因；E2FB位点的CC基因型频率为0，CT基因型频率为0.876，TT基因型频率为 0.123，C等位基因频率为0.438，T等位基因频率为0.562，T基因为优势等位基因。经χ2检测表明，该群体的Leptin基因多态位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P<0.05)。Leptin基因位点E2JW 的纯合度高(0.880)、杂合度低 (0.187)；而E2FB位点则相反，其纯合度低 (0.120)、杂合度高(0.880)。E2JW位点PIC为 0.305，为中度多态，E2FB位点PIC为0.195，为低度多态。

表1 Leptin基因群体遗传参数和频率

2.3 基因型与肉质性状的相关性分析

2.3.1Leptin基因E2JW位点不同基因型肉质性状的比较 由表2可见，AA型和TT型背最长肌纤维直径极显著小于AT型(P<0.01)，而AA型背最长肌纤维直径也显著小于TT型(P<0.05)；而AA型和TT型背最长肌纤维视野面积/结缔组织面积之比极显著显著小于AT型 (P<0.01)，但AA型背最长肌纤维视野面积/结缔组织面积之比显著大于TT型(P<0.05)；3 种基因型肌纤维的密度无差异。

由表3和表4可知，AA型背最长肌纤维羟脯氨酸质量分数显著高于AT和TT型(P< 0.05)。3 种基因型之间剪切力和肌苷酸质量分数指标无显著差异。且3 种基因型背最长肌纤维各种氨基酸质量分数无显著差异。

表3 E2JW位点不同基因型的背最长肌肌苷酸、羟脯氨酸质量分数和嫩度

表4 E2JW位点不同基因型的背最长肌中氨基酸质量分数

从表5得知，AA型背最长肌中肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸的质量分数在3 种基因型中均为最高，与AT和TT型差异极显著(P<0.01)，而硬脂酸最低，与AT和TT型差异显著(P<0.05)。AA型背最长肌中亚油酸和亚麻酸质量分数 最低。

表5 E2JW位点不同基因型的背最长肌脂肪酸组成

2.3.2Leptin基因E2FB位点不同基因型肉质性状的比较 从表6可以看出，CT型背最长肌的肌纤维直径极显著小于TT型(P<0.01)，而CT和TT型间肌纤维密度和视野面积/结缔组织面积之比无显著差异(P>0.05)。

表6 E2FB位点不同基因型的背最长肌肌肉组织学性状

由表7 可知，CT型小于TT型的剪切力、羟脯氨酸、肌苷酸质量分数，差异均不显著(P>0.05)。

表7 E2FB位点不同基因型的背最长肌肌苷酸、羟脯氨酸质量分数和嫩度

由表8可知，CT型背最长肌中天冬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸的质量分数均小于TT型(P<0.05)，且CT型背最长肌中丝氨酸质量分数极显著低于TT型(P< 0.01)。其他氨基酸质量分数在两种基因型之间无显著差异(P>0.05)。

表8 E2FB位点不同基因型的背最长肌氨基酸质量分数

由表9 可知， CT型背最长肌中硬脂酸质量分数极显著小于TT型(P<0.01)，亚油酸质量分数显著小于TT型(P<0.05)，而亚麻酸质量分数显著大于TT型(P<0.05)。

表9 E2FB位点不同基因型的背最长肌脂肪酸质量分数

3 讨 论

3.1 Leptin基因多态性及群体遗传学分析

Lagonigro等[26]对荷斯坦×夏洛来杂交公牛Leptin基因第2外显子的遗传多态性进行研究，发现该区域存在E2JW(A252T)位点。而本试验在新疆褐牛群体Leptin基因第2外显子处并未发现此位点，这可能是由于肉牛品种不同所造成，试验选择的肉牛群体为经过长期杂交改良形成，具备较高肉用性能的本地肉牛品种，研究表明此位点多态性对肌内脂肪、皮下脂肪、背膘厚、大理石花纹等级等肉用性状无显著影响。但本研究在第2外显子区域1 180 bp处检测到一个C/T碱基突变，导致精氨酸变为半胱氨酸。这与Buchanan等[15]对西门塔尔牛、加拿大牛及其杂交肉牛Leptin基因第2外显子研究发现的E2FB(C305T)位点结果一致，表明本研究所检测到的 1 180 bp处突变位点即为E2FB位点。遗传多态性分析表明，在新疆褐牛群体中Leptin基因第2外显子E2JW存在3种基因型，E2FB存在2种基因型；E2JW处于中度多态而E2FB处于低度多态。χ2适合性检验结果表明，该群体的Leptin基因多态位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态。说明其基因型分布可能受到育种过程中自然或人工选择的影响，导致群体出现偏离平衡的状态。Leptin基因位点E2FB的杂合度最高为 0.880，杂合度越高群体的遗传多样性信息也越多，数值越大基因丰富度越高。而Leptin基因位点E2JW群体纯合度最低为0.120，说明越接近纯种。

3.2 不同基因型与胴体品质和肉质性状的相 关性

Schenkel等[16]报道了E2FB和E2JW位点SNP的互作效应对背最长肌嫩度的影响，仅提到了E2JW位点T等位基因与A等位基因间剪切力值显著不同，却没有详细描述。在E2JW背最长肌中，AA型的肌纤维直径、视野面积/结缔组织面积比值均显著小于AT型和TT型(P< 0.05)；AT和TT型剪切力均小于AA型(P< 0.05)、AA型背最长肌中的肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸含量在3种基因型中均为最高，与AT和TT型均差异显著(P<0.05)，而硬脂酸最低，与AT和TT型差异显著(P<0.05)。背最长肌中亚油酸和亚麻酸含量为AA型最低。

Lagonigro等[26]和Kononoff等[27]利用SSCP技术研究E2FB(C305T)位点，结果发现CC、TT、CT 3种基因型，且CC型个体屠宰质量大于TT型，但CC型和CT型个体之间屠宰质量差异不显著；刘洪瑜[28]研究也表明该位点在秦川牛群体内存在CC、TT和CT 3种基因型，CC和CT型个体的宰前活质量、背膘厚极显著高于TT型个体。在本试验肉牛群体中仅发现AA和AB两种基因型，AA型为优势基因型，且该基因座位上AA型个体的宰前活质量和胴体质量显著高于AB型个体，这与Kononoff等[29]和Lagonigro等[26]报道牛Leptin基因外显子2 E2JW位点多态性与采食量有显著关系，但是与脂肪有关的胴体性状却没有显著相关。

本研究发现E2FB位点CT型背最长肌肌纤维直径极显著小于TT型(P<0.01)，而视野面积/结缔组织面积之比、肌纤维密度上CT与TT型无显著差异(P>0.05)；背最长肌中天冬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸质量分数 CT型均显著小于 TT型(P<0.05)，Yukio等[30]通过关联分析发现日本黑牛Leptin基因外显子 2 的Y7F位点显著影响胴体质量，R25C 位点显著影响C18∶0和C14∶1， A80V位点也显著影响C16∶0、C16∶1、C18∶1的含量。背最长肌CT型硬脂酸含量极显著小于TT型(P< 0.01)，亚油酸含量显著小于TT型，而背最长肌中亚麻酸含量CT型大于TT型。Schenkel等[16]、Buchanan等[15]、Nkrumah等[31]、Crews等[32]对牛Leptin基因外显子2 E2FB位点研究发现其多态性对脂肪级别和平均脂含量有显著影响，但与大理石纹的相关性不显著，还与胴体级别及性状和瘦肉率有关。Larissa等[33]、Silva等[34]报道了Nellore cattle 的Leptin基因与生长、胴体性状的相关性，分析发现 SNP A59V 与膘厚度、屠宰后肉色相关，微卫星位点BM1500与屠宰后皮下脂肪厚度相关，这两个位点有可能作为选择标记。

4 结 论

本研究结果表明Leptin基因外显子2 E2JW和E2FB位点的多态性信息含量不同。两位点不同基因型与背最长肌纤维直径、视野面积/结缔组织面积比值及部分脂肪酸和氨基酸含量指标差异性均显著相关。