墙藓属(Tortula Hedw.)2种藓类植物孢子萌发与原丝体发育特征研究

黄士良，颜 丽，金红霞，王明维，王碧雪，李 琳，王振杰

(1.河北女子职业技术学院，石家庄 050091；2.河北外国语学院，石家庄 050091；3.河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050024；4.河北工业职业技术学院，石家庄 050091)

目前，国内外对藓类植物原丝体发育、配子体发生的相关研究还比较薄弱。国外Hedwig和Nishida是对藓类植物原丝体发育研究比较早的两位专家，对藓类植物原丝体的发育研究奠定基础[2]。此后，2011年，Katsumata等[3]研究细胞色素P450单加氧酶CYP78A亚家族在苔藓原丝体生长和配子体形成中的作用；2016年，Ruiz等[4]研究药用多年生苔藓的原丝体悬浮培养；Duckett等[5]和Silvia等[6]对几种苔藓植物原丝体发育特点进行一系列试验观察。国内最早对苔藓植物原丝体发育进行系统研究的学者是高谦等人。1986年，高谦等[7]研究藓类植物孢子萌发和原丝体发育与苔藓植物的各分类群之间的关系及其种系发生与系统演化。2009年，于淑玲[8]对北方美姿藓(Timmiabavarica)的原丝体发育特征进行研究。2014年，魏志颖等[9]以山赤藓(Syntrichiaruralis)嫩茎尖为外植体，研究山墙藓的组织培养条件。自2002年以来，赵建成研究团队开展藓类植物孢子萌发和原丝体发育特征研究，他们的研究为中国藓类植物发育学研究提供了重要的基础资料[10-14]。

无疣墙藓和中华墙藓隶属丛藓科(Pottiaceae)墙藓属(TortulaHedw.)，该科藓类植物多为旱生藓类植物，生境多干旱、寒冷[1,15]。选择墙藓属具有孢子体的2种藓类植物，详细观察其孢子萌发、原丝体发育、配子体发生的过程，并系统分析该属2种藓类植物发育特征，以期从发育学的角度对灰藓科植物系统分类、生态学研究探索一些分类新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自2种藓类植物标本成熟孢蒴内的孢子，标本信息：(1)无疣墙藓TortulamucronifoliaSchwaegr,黄士良N0044(HBNU)，2016年10月11日，河北省平山县宅北乡北滚龙沟(38°29′2.21″N，113°56′45.74″E)，海拔500 m，岩面薄土。(2)中华墙藓TortulasinensiaBroth.,曹珍N0033(HBNU)，2017年8月16日，河北省平山县宅北乡北滚龙沟(N 38°29′ 7.87″,E 113°56′11.08″)，海拔650 m，岩面薄土。凭证标本存放于河北师范大学植物标本馆 (HBNU)。

1.2 试验方法

采用改良 Knop 营养液的固体培养基，基质pH 7.0。改良Knop营养液配方为:1 g/L Ca(NO3)2·4H2O+250 mg/L KNO3+ 250 mg/L KH2PO4+250 mg/L MgSO4·7H2O+ 3 mg/L ZnSO4·7H2O+12.5 mg/L FeSO4·7H2O+微量NaNO3，用蒸馏水补足 1 L。在改良Knop营养液中加入2%琼脂，加热熔化后倒入60 mm的培养皿中制成固体培养基[12-13]。

1.3 试验步骤

培养基的制备：试验组按“1.2”的配方，在一定量的改良Knop营养液中加入适量琼脂，使其浓度为2%，加热熔化后，倒入60 mm的培养皿中，凝固后即可使用[13，15]。

孢子悬液的制备：把孢蒴浸入75%的酒精溶液中，20 s后取出，并在无菌蒸馏水中清洗5次；然后，用镊子和解剖针将孢子取出并散入无菌蒸馏水中，制成适当浓度的孢子悬液[13，15]。

用吸管将稀释的孢子悬液接种于培养基上。

培养皿加盖后放在光照培养箱中培养。温度23 ℃±2 ℃,相对湿度大于80%，光照强度 24 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d。

自接种培养之日起，每天定时镜检孢子发育情况，详细记录个体的发育状况，并进行显微照相及绘图。

在对信息化教学进行反思过程中，从最初对信息化教学的盲目崇拜到理性思考，再到跳出媒体的框框，关注整个教学过程，再到关注师幼互动及其情感交流。在不断地应用和反思中对信息化教学的认识也更加深入。具体如下：

2 结果与分析

生物显微镜下观察，无疣墙藓和中华墙藓的孢子均为球形或椭圆形的单细胞孢子，棕绿色，直径为10～20 μm。通过室内人工培养，两种藓类植物生活史中单倍配子体发育分为孢子吸水膨胀萌发过程，原丝体发育过程，配子体发生过程3个阶段[11,15]。

2.1 孢子萌发过程

2种藓类植物的孢子吸水膨胀萌发阶段可以划分两个明显发育期：(1)孢子吸水膨胀期。室内接种孢子12 h后观察，孢子内叶绿体颜色加深，体积开始缓慢增加。24 h显微镜下观察，2种藓类植物孢子内叶绿体的数目不断增多，无疣墙藓孢子直径达到15～20 μm(图1-1)；中华墙藓孢子吸水后直径达到25～30 μm(图1-2)，吸水后膨胀的体积大于无疣墙藓孢子。(2)破壁萌发期。 36 h时，无疣墙藓有少数孢子开始破壁萌发(图1-3)，形成绿丝体原始细胞(Chloronema primitive cell)，并不断伸长。72 h时，无疣墙藓孢子萌发率为74.1%，萌发极向为1～2极(图1-5)，单极萌发达93%。36 h时，中华墙藓孢子仍处在吸水膨胀期。72 h时，中华墙藓孢子萌发率为 27.6%，萌发极向处在单极萌发阶段，孢子萌发后形成块状原丝体细胞(Massive protonema cell)(图1-4)。90 h时，无疣墙藓和中华墙藓孢子萌发率分别为83.3%和84.3%，中华墙藓萌发率快速提升。两种藓类植物在孢子萌发初期没有产生初生假根(Primary rhizoid)和初生轴丝体(Primary caulonema)。 从2种藓类植物孢子萌发过程看，孢子在萌发初期，产生的极向少。中华墙藓的孢子萌发速度明显低于无疣墙藓的孢子萌发 速度。

2.2 原丝体发育过程

2.2.1 无疣墙藓原丝体发育过程 4 d时，无疣墙藓孢子全部萌发，萌发极向为1～2极，两极萌发率达4%，绿丝体原始细胞缓慢伸长生长，测量长度达到110 μm(图1-6)。6 d时，无疣墙藓孢子两极萌发率达12.5%，两极萌发率还在继续扩大，同时部分绿丝体原始细胞开始分化出具有短圆柱状细胞的一级侧枝，绿丝体分化生长长度已达300 μm(图1-8)。7 d时，无疣墙藓绿丝体分枝明显增多，靠近绿丝体原始细胞处的绿丝体细胞直径开始逐渐变大达到10 μm，绿丝体前段的细胞变化不大，保持在5～7 μm。8 d时，无疣墙藓有30%的主轴绿丝体开始弯曲生长，绿丝体前段开始产生分枝(图1-9)，分枝直径20μm，分枝主要集中在离绿丝体原始细胞500 μm内。10 d时，无疣墙藓绿丝体顶端开始分化产生具有斜壁细胞的轴丝体(Caulonema)(图1-10)，绿丝体细胞上开始分化产生短圆柱状或球状绿丝体细胞，细胞长度50 μm，直径为13 μm。培养11 d时，无疣墙藓的绿丝体系统叶绿体的数量明显增多，在主轴上分化产生的短圆柱状或球状绿丝体细胞逐渐伸长生长，开始有2～3个二级侧枝出现，侧枝细胞长度40 μm，直径为22 μm(图1-11)，但分化速度比较缓慢，分化产生的二级侧枝的绿丝体细胞形态仍为短圆柱状。12 d时，无疣墙藓绿丝体生长发育速度加快，绿丝体系统交织成网状(图1-12)，以绿丝体原始细胞为中心，绿丝体向四周散射生长。绿丝体顶端分化产生轴丝体细胞，轴丝体细胞伸长生长速度是绿丝体细胞生长速度的2～3倍。

2.2.2 中华墙藓原丝体发育过程 5 d时，中华墙藓萌发极向出现2～3极，绿丝体原始细胞生长缓慢，块状原丝体体积增大(图1-7)。8 d时，中华墙藓块状原丝体在体积增大的同时，缓慢伸长生长，并开始产生无序绿丝体分枝(图1-13)，分枝中有一个分枝伸长生长较快。10 d时，观察中华墙藓块状原丝体依然缓慢生长，在块状原丝体上产生的丝状绿丝体缓慢伸长生长(图1-14)。15 d时，中华墙藓还处在原丝体发育阶段。中华墙藓块状原丝体体积膨胀速度加快，直径达到150～200 μm，开始产生气生侧枝，气生侧枝为丝状原丝体，细胞内叶绿体很少，向基质外侧生长。同时，在块状原丝体上产生的绿丝体分枝中，有 1～2个绿丝体分枝迅速伸长生长(图1-15)。 19 d时，从中华墙藓块状原丝体上产生的一枝绿丝体分枝伸长速度明显增快，成为主轴绿丝体，主轴绿丝体前段开始分化产生轴丝体(图1-16)。25 d时，分化产生的轴丝体生长速度快于绿丝体，同时轴丝体细胞开始褐化，轴丝体上开始分化产生绿丝体细胞，而且在轴丝体产生绿丝体细胞处的节点上，再次分化产生块状原丝体，并进一步分化产生成簇状生长的绿丝体(图1-17)。

2.2.3 原丝体发育特征与生境相关性分析 墙藓属2种藓类植物原丝体发育阶段出现的性状特征与其生境有着密切的关系。2种藓类植物的孢子在萌发初期，产生的极向少，在原丝体生长发育阶段分枝少，分枝生长的长度有限，多数在300～500 μm以内。中华墙藓孢子萌发后，首先产生块状原丝体，绿丝体发育更为缓慢。到配子体原始细胞产生时，无疣墙藓整个原丝体系统的生长扩散以绿丝体基细胞为中心，在没有形成复杂的原丝体网络系统时，便快速进入配子体分化阶段。中华墙藓到配子体发生时也没有形成网络状发达的丝状原丝体系统。2种藓类植物均未形成网络状原丝体系统，这种现象和野外生境应该有紧密相关性，墙藓属多为旱生型藓类植物，本试验培育的2种藓类植物，采集生境为干燥石灰岩或钙土，其生存条件干旱少水，极大地影响原丝体发育。无疣墙藓植物在室内环境条件适宜时，孢子会快速萌发，并进入原丝体发育阶段，产生的原丝体为短圆柱状细胞结构，这是防御干旱环境的性状特征。中华墙藓则采用产生块状原丝体来应对干旱环境。多数旱生型藓类植物为了应对干旱环境，会主动调整发育周期，减少原丝体发育阶段时间，产生片状、块状或泡状原丝体，还会采取快速产生配子体和孢子体，完成受精作用，达到短时间内完成生活史的目的[16-17]，即使在室内优越的条件下，其发育过程中依然出现适应野外生境的发育性状特征。

2.3 配子体发生过程

2.3.1 无疣墙藓配子体发生过程 13～14 d时，无疣墙藓绿丝体基部细胞和轴丝体细胞上开始分化产生泡状结构的配子体原始细胞(Gametophyte initial cell)(图1-18)，细胞内部叶绿体较多。培养17 d后，无疣墙藓配子体原始细胞逐渐分化成为桑葚状群体细胞结构，以不对称分裂(Asymmertric division)的方式进行快速分化产生分生细胞团(Meristem)，桑葚状群体细胞结构基部分化产生不含叶绿体的丝状的假根，假根呈正向地性，假根生长速度很快(图1-19)。在20 d开始时，无疣墙藓配子体原始细胞开始分化产生的同时，部分绿丝体细胞的细胞壁逐渐消失，继续培养2 d后，绿丝体细胞发生缢裂，形成细胞数目不等的多个断裂原丝体段，各自独立生长(图1-20)。从22 d开始，无疣墙藓配子体原始细胞的数量快速继续增多，在绿丝体主轴上产生大量配子体原始细胞，并快速分化成桑葚状群体细胞结构，同时轴丝体细胞发生褐化(图1-21,1-22)。24 d时观察，无疣墙藓桑葚状结构的分生细胞团开始快速分化产生幼叶。30 d时，无疣墙藓已分化产生出5～8片幼叶(图1-23)

2.3.2 中华墙藓配子体发生过程 24 d时，中华墙藓块状原丝体体积还在增加，产生气生原丝体，伸向基质外侧(图1-24)，从轴丝体上开始分化产生配子体原始细胞(图1-25)。26 d时，中华墙藓配子体原始细胞分化产生桑葚状群体细胞结构，此时，褐化的轴丝体上每个斜壁细胞处都产生绿丝体分枝，绿丝体分枝很快产生侧枝。产生配子体后，中华墙藓的绿丝体分枝生长速度变慢。30 d时，观察中华墙藓配子体只分化产生2～3片幼叶(图1-26)。

2.3.3 2种藓类植物配子体发生特点分析 从配子体原始细胞产生的时间看，无疣墙藓配子体发生的时间比中华墙藓配子体发生的时间快6 d左右。在配子体发育初期，无疣墙藓配子体原始细胞产生的数量明显比中华墙藓的数量多。在配子体发育中后期，2种藓类植物的原丝体发育速度也逐渐变慢。在试验中，中华墙藓在原丝体发育阶段产生块状原丝体，可能因此推迟了中华墙藓原丝体系统发育速度和配子体分化产生的 时间。

3 讨论与结论

3.1 两种藓类植物孢子萌发型与系统发育

3.1.1 孢子萌发型 藓类植物稳定的发育性状是确定孢子萌发型的关键因素。无疣墙藓孢子为壁外1～3极萌发，具有长圆柱状的丝状原丝体；绿丝体上分化产生丝状轴丝体；在绿丝体或轴丝体上分化产生配子体原始细胞。中华墙藓孢子为壁外萌发，在壁外绿丝体原始细胞首先分化产生块状原丝体，在块状原丝体上分化产生绿丝体和轴丝体，其轴丝体在发育中期易发生褐化。中华墙藓配子体原始细胞在块状原丝体上产生，也可以在轴丝体上分化产生。根据以上发育特点，参照Nishida对藓类植物发育类型划分标准，确定无疣墙藓和中华墙藓的孢子萌发型分别为真藓型(Bryum-type)和缩叶藓型(Ptychomitrium-type)[2,15-17]。

3.1.2 孢子萌发型与其系统发育地位 依据藓类植物外部形态特征和稳定的发育特征，分析其演化地位将更为科学。在原丝体的性状演化顺序上，块状原丝体与丝状原丝体相比，块状原丝体特征是相对原始的，丝状原丝体表现出原丝体发育形态中的最高级的性状特征[2]。研究的2种墙藓属藓类植物中，中华墙藓原丝体在发育过程中出现块状原丝体，说明与无疣墙藓相比，其演化位置相对原始，即萌发型为缩叶藓型的藓类植物，从发育学的角度看，其发育性状较为原始。2种墙藓属植物在原丝体发育过程中都是以丝状原丝体为主体，无疣墙藓的丝状原丝体系统明显比中华墙藓的原丝体系统发达。在培养条件优越的环境中，两种藓类植物在原丝体发育阶段依然出现短圆柱状原丝体和块状原丝体，说明这两种发育性状在演化上是稳定的，不会因生境条件改变，随时调整原丝体发育形状，改变孢子萌发型，这为本属藓类植物原丝体发育演化路线向着丝状原丝体发展趋势提供了有力佐证[12,18-20]。王利松等[21]遵循Frey和Stech的系统，将中华墙藓从丛藓科墙藓属划分到赤藓属(SyntrichiaBrid.),本研究从两种藓类植物孢子萌发型的差异性角度分析，支持对该种的划分。块状原丝体是藓类植物为了适应干旱环境而产生的一种适应机制，可以作为一种分类学的特征，但不能因一个发育性状特征便决定该种演化地位高，还需要更多经典分类学的性状作依据。

3.2 孢子萌发型与生殖策略

从藓类植物生境的多样性可以看出生殖策略的多样性。面对高大的被子植物，藓类植物的生境选择存在压力，因此，身体矮小的藓类植物为了扩大种群数量，保持了生殖策略的多样性，从而拥有更强大的适应性。作为同一属的藓类植物，孢子萌发型却存在较大差异性，萌发型为缩叶藓型的中华墙藓在原丝体发育阶段初期产生了块状原丝体，虽然这种性状表明是对较为干旱环境的适应结果，但在室内培养阶段水分充足，其发育过程依然出现块状原丝体。说明藓类植物在演化过程中，为了抵御极端环境，生活史中产生了块状原丝体发育阶段，顺利的让藓类植物过渡到配子体发生时期，从而保障了生活史的顺利完成，这一防御性状也被保留下来。如在配子体发育阶段，芽孢墙藓(Tortulapagorum)在配子体上产生芽孢，以抵御不良环境，这与无疣墙藓的短圆柱状原丝体、中华墙藓原丝体发育阶段产生的块状原丝体采取的都是相同生殖策略。

墙藓属2种藓类植物在试验条件下，均完成从孢子萌发到原丝体发育，再到配子体产生的过程。实验室培养条件优越，水分充足，却很少藓类植物在试验条件下产生孢子体。表明在外界环境优越，尤其是水分充足的条件下，藓类植物生殖策略选择r型生态对策，选择通过无性生殖达到扩大种群目的，避免发生有性生殖带来的生物能量过度消耗[12,16-17]。从藓类植物生活史完成的时间长短看，本研究认为存在两种情况，一是因为生长条件优越，藓类植物直接采用无性繁殖直接达到了扩大种群数量的目的，而不用采用产生孢子体，完成生活史，或者推迟产生孢子体的时间；二是由于藓类植物在发育过程中，遇到了极端环境，阻碍了配子体或孢子体的分化产生，等生长条件允许时，继续生长，来完成生活史的每个阶段。中华墙藓原丝体发育阶段产生的块状原丝体是对极端不良环境的适应，减缓了生长发育的速度，因此，在优越条件下培养时，因产生块状原丝体，同样使得配子体发生的时间推迟。这一点在试验中得到验证，如无疣墙藓配子体原始细胞发生的时间为20 d，而中华墙藓的配子体原始细胞发生时间为26 d，中华墙藓的配子体发生时间，因产生块状原丝体，发育时间比无疣墙藓推迟6 d。

综上所述，墙藓属2种藓类植物孢子均为壁外萌发，无疣墙藓绿丝体细胞为短圆柱状细胞，能分化产生轴丝体。配子体在绿丝体和轴丝体上均能产生。中华墙藓孢子萌发在壁外产生块状原丝体，丝状绿丝体在块状原丝体上产生，分化产生轴丝体。无疣墙藓和中华墙藓配子体分别在绿丝体上和轴丝体、块状原丝体上产生。参照Nishida对藓类植物孢子萌发和原丝体发育类型划分标准，墙藓属无疣墙藓和中华墙藓原丝体发育类型分别为真藓型和缩叶藓型。2种藓类植物的发育特征为墙藓属植物的分类学研究提供了一些有益数据。