内蒙古地区蒙古族哮喘患者外周血单个核细胞miR-34b-5p、miR-150水平及意义①

张 园 朱天吉

(内蒙古医科大学附属医院呼吸内科，呼和浩特 010000)

哮喘是一种属于全球性难治的慢性呼吸道炎症反应疾病，以胸闷、喘息、咳嗽等反复发作为其临床症状，发病率逐年上升，严重影响患者日常生活工作[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)广泛分布于机体内各种细胞和组织中，且具有调节作用的一种小分子RNA，在多种疾病发生时异常表达，有望作为诊断多种疾病的临床指标[2]。哮喘发生后，患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中miRNA表达失调[3]。微小RNA-34b-5p(microRNA-34b-5p，miR-34b-5p)在哮喘患者血清中呈高表达，可作为哮喘的临床检测指标及治疗靶点[4]。Zhang等[5]研究显示微小RNA-150(microRNA-150，miR-150)表达可抑制lncRNA BCYRN1表达，进而影响气道炎症反应。但miR-34b-5p、miR-150在内蒙古地区蒙古族哮喘患者PBMC中的表达水平及两者联合诊断哮喘的研究尚未发现相关研究报道。因此，本研究通过初步研究miR-34b-5p、miR-150在内蒙古地区蒙古族、汉族哮喘患者PBMC中的表达水平，分析两者联合诊断价值，以期为内蒙古地区蒙古族、汉族早期诊治哮喘提供临床参考资料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1一般临床资料 选取2013年1月～2014年1月本院确诊的蒙古族哮喘患者120例为蒙古哮喘组，其中男58例，女62例；年龄23～64岁，平均年龄(43.02±10.68)岁。以同期本院就诊的120例汉族哮喘患者为汉族哮喘组，其中男56例，女64例；年龄24～66岁，平均年龄(44.28±10.76)岁。并选择同期健康体检者120例(蒙古族63例，汉族57例)进行对照研究为健康组，其中男60例，女60例；年龄22～65岁，平均年龄(43.96±10.70)岁。三组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

哮喘诊断标准：依据2012年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的哮喘判定标准[6]。纳入标准：①所有患者符合哮喘纳入标准；②所有研究对象祖籍三代均居住于内蒙古地区；③无异族通婚史；④生理病理检查资料完整者。排除标准：①患有糖尿病、高血压、慢阻肺等慢性疾病者；②患有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫系统疾病者：③合并严重的慢性全身性疾病者；④合并急慢性感染者。哮喘严重程度分级：轻度：症状≥1次/周，但<1次/d，可能影响睡眠，夜间哮喘症状>2次/月，但<1次/周，FEV1≥预计值80%或PEF≥个人最佳值80%，PEF变异率为20%～30%。中度：每日有症状，影响活动和睡眠，夜间哮喘症状>1次/周，FEV1预计值60%～79%或PEF个人最佳值60%～79%，PEF变异率为>30%。重度：每日有症状，频繁出现，夜间哮喘症状经常发生，体力活动受限，FEV1预计值60%或PEF个人最佳值60%，PEF变异率为>30%。

1.1.2主要试剂 Ficoll淋巴细胞分离液购于美国GE公司；TRIzol试剂盒、Reverse Transcription System试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix Kit均购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法

1.2.1样本采集及预处理 三组受试者于晨起空腹状态下采集外周静脉血6 ml，分别置于两个管中，其中一个用于炎症因子测量；另一份置于含有EDTA-K2抗凝管中，以Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离所有样本PBMC，保存于-20℃冰箱中，待测。

1.2.2RT-PCR法检测两组PBMC中miR-34b-5p、miR-150的表达水平 取出-20℃冰箱中保存的PBMC样本，冰上解冻，参照TRIzol试剂盒说明书加TRIzol裂解液，按其说明书具体操作流程从PBMC样本中抽提总RNA。利用紫外分光光度计检测抽提RNA样本在波长260 nm、280 nm处的吸光度(A)，以A260/A280比值在1.8～2.0，表示抽提RNA样本纯度良好。以纯度良好的RNA样本为模板，依照Reverse Transcription System试剂说明书将其逆转录成cDNA。依据SYBR Green PCR Master Mix Kit试剂盒操作说明书配制目标PCR反应体系，将目标cDNA扩增、定量检测。miR-34b-5p、miR-150均以U6为内参。以2-ΔΔCt法计算miR-34b-5p、miR-150相对表达量。各引物序列见表1。

表1 miR-34b-5p、miR-150及内参U6的引物序列Tab.1 Primer sequences of miR-34b-5p,miR-150 and internal reference U6

1.2.3检测一秒用力呼气流量(forced expiratory volume in one second,FEV1)占预测值的百分比(FEV1%) 所有受试者静息30 min，利用肺功能仪行肺功能检测 FEV1%，连续检测3次求平均值。1.2.4ELISA检测血清中炎症因子水平 将试管中血液样本进行离心后取上清液，检测所有受试者全血中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13含量，按照对应试剂盒说明书操作步骤进行含量检测。

2 结果

2.1各组miR-34b-5p及miR-150表达水平、肺功能指标、炎症因子比较 汉族哮喘组和蒙古哮喘组患者miR-34b-5p、IFN-γ、IL-2水平及FEV1%均明显低于健康组，miR-150、IL-4及IL-13显著高于健康组(P<0.05)；蒙古族和汉族患者IFN-γ、IL-2水平及FEV1%比较无显著差异(P>0.05)；蒙古族miR-34b-5p水平显著低于汉族；而miR-150、IL-4及IL-13水平显著高于汉族(P<0.05)，见表2。

表2 各组miR-34b-5p及miR-150表达水平、肺功能指标、炎症因子比较Tab.2 Comparison of miR-34b-5p and miR-150 expression levels,lung function indicators and inflammatory factors in each

2.2与疾病严重程度的相关性分析 根据所有哮喘患者疾病严重程度分为轻度(n=129)、中度(n=99)及重度(n=12)。以疾病严重程度为自变量(0=轻度，1=中重度)，以炎症因子IFN-γ(实测值)、IL-2(实测值)、IL-4(实测值)、IL-13(实测值)、miR-34b-5p(实测值)、miR-150(实测值)、FEV1%(实测值)为自变量进行有序Logistic多元回归分析，结果显示miR-34b-5p为疾病严重程度的保护因素(OR=0.081，P=0.023)，而miR-150为疾病严重程度的危险因素(OR=20.898，P=0.015)，见表3。

表3 Logistic多因素回归分析结果Tab.3 Logistic multivariate regression analysis results

2.3miR-34b-5p、miR-150表达水平预测内蒙古地区哮喘疾病的效能分析 对三种检测方式对两族哮喘患者诊断的结果显示，两族患者开展联合检测的诊断效能均显著优于 miR-34b-5p及miR-150单一检测(z=12.257,10.947,P<0.001)，见表4、图1。

表4 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表达水平及二者联合预测蒙古族哮喘发生的效能Tab.4 Expression levels of miR-34b-5p and miR-150 in PBMC and their combined predictive efficacy in Mongolian asthma

图1 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表达水平预测汉族及蒙古族哮喘发生的ROC曲线Fig.1 ROC curve of miR-34b-5p and miR-150 expression levels in PBMC predicting occurrence of asthma in Han nationality and Mongolian asthma

3 讨论

哮喘是由多种炎症细胞、炎症因子参与引发的呼吸系统疾病，以气流受阻为临床特征，可引起肺脏甚至全身症状，严重影响患者身心健康及社会正常活动[7]。因此，寻找可早期诊治哮喘的可靠指标，对哮喘病情及时防控，是临床医学面临的重要课题。

miRNA是机体内一类长度约22个核苷酸的RNA小分子，可参与并调节细胞增殖、信号转导、免疫炎症反应等生化过程[8]。Huang等[9]研究显示miR-199a-5p在哮喘患者血浆中表达上调，与肺功能指标FEV1呈负相关，miR-199a-5p可调节炎症过程，并进行信号传导，从而促进哮喘疾病发生与发展。miR-98在哮喘患者外周B细胞中表达异常，与血小板反应蛋白1具有负相关性，两者共同影响哮喘发病进展[10]。miR-1165-3p在哮喘患者血清中呈过表达，其可作为过敏性哮喘的诊断标志物[11]。以上研究表明，miRNA表达异常与哮喘发作关系密切。miR-34在哮喘患者中下调，与自噬、纤维化、气道炎症、气道重塑相关，miR-34是哮喘的潜在生物标志物和治疗靶标[12]。Wang等[13]研究发现miR-34在慢性阻塞性肺病患者中表达下降，经白藜芦醇治疗后表达上调，表明miR-34可能参与并影响肺部炎症反应过程。miR-34b-5p在哮喘患者血清中表达下调，其具有哮喘临床诊断价值[4]。本研究中汉族哮喘组和蒙古哮喘组患者PBMC中miR-34b-5p水平均低于健康组，提示miR-34b-5p在哮喘发病进展中起一定作用。miR-150在慢性阻塞性肺病中表达异常，其可能通过影响肺部炎症和气道上皮细胞，进而影响慢性阻塞性肺病的发生、发展[14]。miR-150在髋部骨折引发的全身性炎症和急性肺损伤血清中表达异常，可作为髋部骨折后急性肺损伤诊断和预后的可靠生物标志物[15]。以上研究表明，miR-150在肺部炎症疾病中表达异常，其可能参与并影响肺部炎症类疾病。本研究中汉族哮喘组和蒙古哮喘组患者PBMC中miR-150水平均明显高于健康组，且蒙古哮喘组患者PBMC中miR-150水平明显高于汉族哮喘组，提示miR-150可能在不同种族哮喘发生与发展中发挥不同程度的作用。

哮喘患者常伴有肺功能改变特征，肺功能检测可作为哮喘鉴别诊疗的重要方法[16]。哮喘发生时，与其密切相关的淋巴细胞Th1、Th2分泌的炎症因子水平发生变化[17]。本研究中汉族哮喘组和蒙古哮喘组患者FEV1%，外周血中IFN-γ、IL-2水平均明显低于健康组，IL-4、IL-13水平明显高于健康组，且蒙古哮喘组患者外周血中IL-4、IL-13水平及PBMC中miR-150明显低于汉族哮喘组，提示同一地区哮喘患者肺功能指标、炎症因子与健康组存在差异，肺功能指标、炎症因子可能影响哮喘。根据既往动物模型研究结果显示，miR-34b-5p是参与到巨噬细胞激活及极化的重要因素，过表达miR-34b-5p可以诱导巨噬细胞功能激活，从而导致炎症介质的释放[18]。而IL-4亦可以通过激活巨噬细胞参与到哮喘的发生和发展机制中，二者之间可能存在显著关系，但具体机制尚不清楚，而根据本次研究推测，蒙古族哮喘患者由于miR-34b-5p高表达可导致巨噬细胞显著极化，从而影响外周血中IL-4及IL-13的含量。同时还有研究结果显示，敲除miR-150基因后会导致血液中性粒细胞含量显著下降[19]，故可以认为此基因表达可以显著促进炎症反应，根据两族患者之间miR-150表达情况来看，汉族患者miR-150表达量显著高于蒙古族，提示蒙古族患者哮喘发生后炎性反应更加严重，这也证实了之前对于IL-4及IL-13的含量的研究结果。但上述均为笔者根据既往研究结果推测所得，其详细机制还需要开展大量的基础研究及临床对照研究证实。

进一步研究发现，miR-34b-5p及miR-150是内蒙古地区哮喘患者疾病严重程度的独立影响因素。为miR-34b-5p疾病严重程度的保护因素，而miR-150为疾病严重程度的危险因素。上述两种miR与哮喘患者炎性因子的相关性在之前的研究已经被证实，而本结果提示上述两组指标对哮喘疾病严重程度具有较好的判断性，这与其在体内受疾病影响的敏感度较高，且受其他因素的影响较小有关。同时本研究还显示，PBMC中miR-34b-5p、miR-150对内蒙古地区发生哮喘均有一定的诊断价值，但单独诊断效能较低，两者联合能有效提升诊断的效能，但对于不同种族之间的二者诊断效能的比较还有待大样本研究进行证实。

综上所述，内蒙古地区蒙古族哮喘患者PBMC中miR-34b-5p表达下调，miR-150表达上调，两者联合对哮喘诊断具有较高的诊断价值。但本研究实验样本量较少，结果可能存在一定偏差，后期将加大研究样本量进行深入研究。