克敏芪丹鼻喷剂对气虚血瘀证变应性鼻炎大鼠血清IL-4、PAF的影响①

慕德宏 刘慧霞 李东棋 刘 婷 丁 鹏 田 理

(成都中医药大学附属医院，成都 610072)

过敏性鼻炎西医学又称为变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，是IgE介导的与过敏原相关的非特异性炎症[1]。流行病学研究表明，AR发病率逐年上升，影响全世界高达40%的人口[2]。AR易复发、易伴随并发症，是变态反应性疾病研究热点，已成为全球性健康问题。鼻喷剂是临床治疗AR的重要剂型之一，《灵枢·杂病第二十六》即有提及“哆以草刺鼻，嚏而已”，吴师机所撰《理瀹骈文》已形成较为完整的鼻腔给药理论体系，其“外治之理即内治之理”为克敏芪丹鼻喷剂治疗AR提供了理论基础。纯中药克敏芪丹鼻喷雾剂(益气活血法)是田理教授基于“肺心同治”和经验方剂治疗AR的有效方剂，临床研究表明其对AR症状控制及预防复发有显著优势，为开发纯中药鼻用新制剂奠定了基础[3]。本实验采用克敏芪丹鼻喷雾剂治疗气虚血瘀证AR大鼠，对克敏芪丹鼻喷雾剂的作用机制，并对其药物组成进行简单探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 7～8周龄SPF级SD大鼠65只，体质量(230±10)g，由成都达硕动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2015-030。(23±2)℃、相对湿度(50±5)%条件下饲养，保持室内安静，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2药物 卵清蛋白(OVA，批号：A5503-5G，1 g/瓶)购自Sigma-Aldrich公司；氢氧化铝购自哈药集团生物制药有限公司；克敏芪丹鼻喷剂由成都中医药大学附属医院药剂科提供；内舒拿鼻喷剂购自默沙东公司。

1.1.3试剂与仪器 0.5%OVA Al(OH)3溶液配制：称取卵清蛋白50 μg+氢氧化铝粉末5 mg+生理盐水1 ml混匀备用；0.6%OVA生理盐水配制：称取60 mg OVA至10 ml生理盐水中，混匀备用。IL-4和PAF ELISA试剂盒购自ThermoFisher公司；全自动血流变仪购自北京普利生仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1气虚血瘀证AR大鼠模型的建立及分组 大鼠造模分为冷水力竭游泳制造气虚血瘀证及腹腔注射与鼻腔滴注OVA激发AR 2个阶段[4]。采用游泳力竭法+寒湿+高脂饮食法构建气虚血瘀证模型，先将大鼠进行为期1周的游泳训练，2 d/次，2～3 min/次，以适应游泳环境。8℃冷水进行力竭游泳造模，连续14 d，力竭标准为全组50%大鼠出现自然沉降，达标后全组大鼠停止游泳，同时高脂饲养。14 d后，大鼠毛色发黄，毛发粗糙，体型瘦弱，情绪暴躁，大便松散不成型；无创血压仪测量大鼠收缩压(systolic pressure，SBP)、平均动脉压(mean blood pressure,MBP)和舒张压(diastolic pressure,DBP)均不同程度地下降。大鼠由于长时间游泳体力消耗，脑组织处于严重缺氧状态，长久致气虚；因处于冷水环境中，血液遇寒则凝，致血瘀；气行血，气虚无力推动血液运行致血瘀。

腹腔注射0.5%OVA Al(OH)3混悬液诱导过敏，2 d/次，共14 d；空白组给予Al(OH)330 mg+生理盐水1 ml混悬液，2 d/次，共7次。全身抗原攻击完成后，滴鼻给予0.6%OVA生理盐水，每只每侧50 μl，1 d/次，共7次。空白组给予等量生理盐水。30 min内观察大鼠是否出现搔鼻、喷嚏、鼻溢液及觅食等行为。造模完成后观察大鼠有无懒动、脱毛、易惊、便溏、舌底紫暗、眼球暗红等气虚血瘀症状及挠鼻、打喷嚏、流涕等AR症状，空白组和模型组各取5只大鼠抽血检测血液流变学指标。根据鼻部症状评分标准对鼻炎症状进行评分:鼻痒，轻擦鼻，记1分;到处摩擦，抓挠鼻、面部不止，记2分;喷嚏1～3个记1分，4～10个记2分，11个以上记3分;鼻涕流至前鼻孔记1分，超过前鼻孔记2分，流涕满面记3分[5]。通过舌色和舌底静脉长度观察舌状态。无紫暗，舌底色微青、舌静脉主干长度不超过3/4,记0分;轻度紫暗，舌底色紫暗或舌静脉主干长度超过3/4,记1分;明显紫暗，舌底色紫暗且舌静脉主干长度超过3/4,记2分[6]。便溏亦为气虚血瘀证常见症状。对大鼠便溏状况拟定的评分标准如下：大便成形,粪质柔软,记0分;轻度异常，粪便稀溏部分不成形,记1分;明显异常，粪便稀溏完全不成形,记2分。总分多于7分为造模成功。大鼠分为空白对照组、模型组、中药低量组、中剂量组、高剂量组和西药组。

1.2.2给药方法 滴鼻给予各中药组大鼠我院自制克敏芪丹鼻喷剂(0.010 8、0.021 6、0.043 2 g/ml)，主要含黄芪、川芎等药物，每侧鼻孔滴注1次。西药组滴鼻给予内舒拿鼻喷剂5 μl，每侧鼻孔滴注1次，连续给药14 d。空白组正常摄食饮水，模型组给予高脂饲料，并为正常饮食量的1/3，不限水，直至造模结束。

1.2.3标本采集 于末次给药后24 h取全血5 ml，3 000 r/min离心15 min，置于洁净干燥玻璃试管中密封，-20℃保存。组织标本制定：去除大鼠下颌骨上颌骨外周皮肤及周围软组织，沿鼻中隔软骨和骨交界处以冠状面切开部分鼻软组织，鼻背正中切开，取出鼻中隔及鼻腔外侧壁呼吸区黏膜组织，4%多聚甲醛溶液固定，常规切片并进行HE染色。

1.2.4指标检测 观察大鼠有无搔鼻、喷嚏、鼻溢液等AR典型症状。HE染色后在显微镜下观察大鼠鼻黏膜病理改变。采用ELISA试剂盒检测大鼠血清IL-4、PAF含量，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3统计学处理 采用SPSS23.0软件进行数据分析，各组数据经正态检验和方差齐性检验后，组间比较采用单因素方差分析。方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐采用Tamhane′s T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠血液流变学指标观察 空白组和模型组各随机取5只大鼠进行血液流变学检测，见表1，与对照组相比，模型组大鼠低切、血浆黏度、红细胞聚集指数升高(P<0.05)，中切及高切差异无统计学意义(P>0.05)。结合大鼠AR症状判定可继续实验，同时用药阶段仍进行游泳及OVA滴注以维持造模。

表1 大鼠血液流变学指标Tab.1 Serum rheological parameters of

2.2大鼠行为及体征观察 各组治疗前与空白对照组评分差异均有统计学意义(P<0.05)；给药7 d后，中药各剂量组和西药组大鼠评分均降低，除中药低剂量组外均与给药前差异具有统计学意义(P<0.05)；给药14 d后，中药各剂量组和西药组大鼠评分继续降低，与给药7 d后评分差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组给药7、14 d评分均有不同程度改善，与对照组差异具有统计学意义(P<0.05)，其中中药高剂量组、西药组改善最为显著，与中药低量组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 给药后第1、7、14天大鼠行为及体征评分分)Tab.2 Behavioral and physical signs scores of rats at 1,7 and 14 d after

2.3鼻黏膜病理学观察 空白对照组大鼠鼻黏膜组织完整，黏膜上皮各层细胞排列较整齐，偶见脱落，固有层可见腺管和散在血管，间质无水肿变性;模型组大鼠鼻黏膜上皮细胞变性坏死，嗜酸性粒细胞浸润，AR气虚血瘀证中药高量组大鼠鼻黏膜上皮部分完整，纤毛柱状上皮排列较整齐，固有层结构较清晰，中、低剂量组固有层内可见少量炎症细胞浸润，黏膜上皮细胞增生肥厚及变性、边缘不清，低剂量组尤甚；西药组可见少量淋巴细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞散在分布于固有层或黏膜上皮，结构基本完整。见图1。

图1 各组大鼠鼻黏膜病理切片HE染色图(×400)Fig.1 HE staining figure of pathological sections of nasal mucosa of rats in each group(×400)

2.4大鼠血清IL-4、PAF表达比较 如表3所示，造模后模型组大鼠血清IL-4、PAF水平明显上升，与空白组大鼠相比差异有统计学意义(P<0.01)；用药14 d后，中药各剂量组、西药组大鼠血清IL-4指标水平较模型组下降，其中中药高剂量组、西药组与模型组差异有统计学意义(P<0.05)，与空白组差异无统计学意义(P>0.05)；各治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组PAF水平均有所下降，但仅有中药高剂量组PAF既与模型组有统计学意义(P<0.05)，又与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清IL-4、PAF水平Tab.3 IL-4 and PAF levels of rats of each

3 讨论

IL是一组由多种细胞分泌的、结构和功能各异的可溶性蛋白，具有调节细胞生长、分化及免疫活性等作用[7]。AR是发生于鼻黏膜的Ⅰ型变态反应，是以IgE为主导、多种细胞因子和免疫细胞参与的非特异性炎症反应[8]。IL-4主要由活化的Th2细胞分泌，是IgE的特异性诱导剂[9]。IgE与变应原结合产生以Th2细胞免疫为主导的病理改变，导致鼻黏膜血管扩张、清水样鼻腔分泌物增多，黏膜苍白水肿[10]。IL-4作用于胆碱能神经导致腺体分泌旺盛、清水样鼻腔分泌物，作用于感觉神经导致鼻痒、打喷嚏等相关AR症状[11]。提示IL-4含量与鼻黏膜炎症程度及机体过敏状态相关。血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)可引起血管通透性增加，渗出增多，促进炎症物质释放，还可诱导血小板聚集，是AR发病的另一重要炎症介质。正常情况下，PAF在体内含量较低[12，13]。AR患者由于长期变应原刺激，不但使PAF浓度升高，还会使其活性增强[14]。

克敏芪丹鼻喷剂由黄芪、防风、川芎等组成，补益脾肺，扶正气，固护卫表，黄芪味甘、温，归肺、脾经，具有补气固表之效；川芎辛、温，入心包经，有活血化瘀，兼行气之能，被誉为“血中气药”，其合用有“补气而不闭邪，活血而不伤正气”之特点，共奏益气活血通窍之功效。AR气虚血瘀证患者鼻腔内黏膜水肿，分泌物增多，使鼻腔内组织处于持续炎症浸润，导致血管通透性增高，加重局部症状[15]。采用益气活血鼻喷剂直接作用于上皮细胞被破坏的鼻黏膜(靶器官)，可缓解鼻内缺血缺氧症状，使毛细血管通透性降低，炎症介质、IL-4减少，血液循环通畅，气滞血瘀症状减轻。

相关研究表明，黄芪可改善机体局部炎症反应，减轻致敏状态，阻止炎症介质释放，降低血清IL-4含量，可能与黄芪有效成分对免疫功能的双向调节作用有关[16]。黄芪多糖为黄芪的主要成分，可促进免疫细胞如T细胞分化成熟，保护心肌及抗氧化，进而起抗炎作用。黄芪多糖在体外还能明显抑制 ADP 诱导的兔血小板聚集，300 mg/L时抑制作用最强，原因可能为通过抑制血小板聚集，进而降低血清PAF含量[17]。

本研究发现，克敏芪丹鼻喷剂和内舒拿均可有效且持续地缓解AR的典型症状。HE染色结果说明，克敏芪丹鼻喷剂对AR引起的炎症因子释放、水肿、血管通透性下降等症状均有良好的缓解作用。2种药物均能改善AR大鼠血清IL-4水平，差异无统计学意义，对单纯性AR疗效大致相同。经克敏芪丹鼻喷剂治疗后，PAF水平相较于模型组有所下降，更接近空白组，而西药组则没有这个效果。说明对PAF水平的改善克敏芪丹鼻喷剂优于内舒拿，由于其兼有益气活血作用，对气虚血瘀证AR的治疗优于内舒拿。

由于造模周期短、强度不够、抽取样本量较少等原因，血液流变学指标中切、高切未表现出明显差异，但由于用药阶段维持造模，血液流变学其他指标差异具有统计学意义，行为学及体征评分统计有显著统计学差异，可认为造模成功，模型组PAF水平与空白组具有显著差异也可说明这一点。

克敏芪丹鼻喷剂作为田理教授结合临床用药治疗AR的纯中药鼻喷剂，目前对其研究及推广还比较少。本研究通过与内舒拿鼻喷剂进行比较，发现克敏芪丹鼻喷剂对AR具有良好的疗效，对气虚血瘀证AR效果更佳。临床证据显示，克敏芪丹鼻喷剂治疗人体气虚血瘀证AR的疗效与内舒拿疗效相当，但克敏芪丹鼻喷雾剂在缓解气虚血瘀症状方面优于内舒拿，推测可能与中药作用于整个机体有关[3]。