不同实验条件对流式细胞术细胞周期分析结果的影响*

秦建兵，李 雯，衣 昕，田美玲，何 辉，金国华*

(南通大学医学院人体解剖学系，南通 226001)

细胞周期是指细胞从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次形成子细胞为止，在此过程中，细胞的遗传物质复制并均匀地分配到两个子细胞。通过流式细胞术检测细胞内DNA 含量来进行细胞周期的分析在细胞生物学以及肿瘤生物学领域已愈来愈普遍。虽然此方法比较简单，但是因为操作者的熟练程度以及不同的实验方法，导致实验结果的重复性及数据的可信度下降。本文针对这一问题展开研究，探讨不同实验条件对流式细胞术细胞周期结果的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 大鼠C6 脑胶质细胞株(吉凯基因)、DMEM/F12 培养基(Corning)、胎牛血清、胰酶(Gibco)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)/核糖核酸酶(ribonuclense,RNase)染色液(BD)、20×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(上海生工生物)、流式细胞仪(BD FACS Calibur)。

1.2 影响因素及实验分组

1.2.1 乙醇浓度对细胞周期的影响 大鼠C6 细胞株贴壁培养至75 cm2细胞培养瓶底面积80%左右，胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，0.01 mol/L PBS洗2 遍，细胞计数后按1×106/管将细胞分配到若干离心管中。按照乙醇浓度分为低(50%)、中(75%)、高(100%)组。置于-20 ℃固定24 h 后检测。

1.2.2 固定方式对细胞周期的影响 按照固定方式分为细胞沉淀滴入预冷75%乙醇组、预冷75%乙醇滴入细胞沉淀组、1 mL PBS 重悬细胞后滴入3 mL预冷无水乙醇组、3 mL 预冷无水乙醇滴入1 mL PBS 重悬细胞组。置于-20 ℃固定24 h 后检测。

1.2.3 染色时间对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，-20 ℃固定24 h，按染色时间分为5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 组。

1.2.4 固定时间对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，按照乙醇固定时间分为2 h、1 d、7 d、28 d 组，分别放置-20 ℃保存后检测。

1.2.5 样品流速对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，-20 ℃固定24 h，分为高流速组(60 μL/min)、中流速组(35 μL/min)、低流速组(12 μL/min)。

1.2.6 细胞浓度对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，-20 ℃固定24 h，分为高浓度组(1×107/mL)、中浓度组(2×106/mL)、低浓度组(0.4×106/mL)。

1.3 染色及上机检测 各组细胞1 000 r/min 离心5 min，小心吸除固定液，加入4 mL 0.01 mol/L PBS重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min，重复1 次，小心吸除PBS，室温下避光加入0.5 mL PI/RNase 染液重悬细胞后待上机检测。BD FACSCalibur 流式细胞仪，以FSC-H 为横坐标，SSC-H 为纵坐标，设置门R1，以FL2-A 为横坐标，FL2-W 为纵坐标，设置门R2，共收集R2 门内20 000 个细胞。

1.4 细胞周期分析 利用仪器自带Modfit 软件(版本号3.3.11)分析DNA 面积直方图，得出各个细胞周期的百分比和变异系数(coefficient of variance,CV)。

1.5 统计学方法 各组数据用SPSS 21.0 软件进行统计，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乙醇浓度对细胞周期的影响 由图1 可见，细胞的G2/M 期细胞与双黏体细胞分离界限清楚，说明仪器的分辨率良好。流式散点图可见无水乙醇组、50%乙醇组细胞碎片明显增多，无水乙醇组细胞FSC 和SSC 信号减小，说明细胞脱水固缩，细胞黏连明显，直方图可见两组较75%乙醇组峰宽明显增加，CV 值增大(P＜0.05)，因此，后续实验均采用75%乙醇固定细胞。

2.2 固定方式对细胞周期的影响 1 mL PBS 重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇组、3 mL 预冷无水乙醇滴入1 mL PBS 重悬细胞组差异无统计学意义(P＞0.05)；细胞沉淀滴入预冷75%乙醇组、预冷75%乙醇滴入细胞沉淀组细胞黏连体增多，周期分析统计结果差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见图2。

2.3 染色时间对细胞周期的影响 5～30 min 间各组S 期和G2/M 期数值变化较大，随着染色时间的延长直方图中的峰变窄，CV 值也明显减小(P＜0.05)，1～12 h 各组间数值基本平稳(P＞0.05)，1 d 以上组细胞周期数值与1～12 h 各组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

2.4 固定时间对细胞周期的影响 细胞经75%乙醇固定后放置-20 ℃保存2 h、1 d、7 d、28 d 组之间除2 h 组CV 值稍高外，周期分析统计结果差异无统计学意义(P＞0.05)，见图4。

2.5 样品上样速度对细胞周期的影响 低流速组与高流速组及中流速组间差异有统计学意义(P＜0.05)，S 期和G2/M 期数值变化较大。且随着流速的增大，直方图中的峰变宽，CV 值也明显增加(P＜0.05)，见图5。

2.6 细胞浓度对细胞周期的影响 周期分析统计学处理结果显示，高浓度组与低浓度组及中浓度组之间差异有统计学意义(P＜0.05)，见图6。

3 讨 论

在细胞周期的不同时期，DNA 含量存在差异，正常细胞G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，G2/M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N)，而S期DNA 含量介于二倍体和四倍体之间[1]。PI 是一种常用的细胞核荧光染料，能嵌入碱基对之间实现与双链DNA 结合，DNA 含量多，嵌入的染料多，荧光强度就高；嵌入的DNA 含量少，荧光强度就低。但PI 无膜通透性，不能透过活细胞膜，乙醇可通过沉淀、失活起到固定作用，同时可溶解脂质起到破膜作用[2]。因此，经乙醇固定，再行PI 染色，用流式细胞术分析已成为当前一种简单、经济的检测细胞周期的方法[3-7]。虽然此方法步骤简单，但由于各种实验条件下实验结果的稳定性较差，导致数据平行性不好，同时样品处理不当导致周期分析的CV 值增大，从而使数据的可信度下降[8-11]。本文从细胞周期检测过程中可能出现的各种影响因素和实验条件的变化，观察其对细胞周期分析结果的影响，以期为广大的流式实验人员，特别是初学者提供实验条件参考。

本研究将乙醇作为固定破膜剂使用，它简便、经济、无毒性，观察到75%乙醇的固定效果无论是从细胞周期各时期的分析结果，还是CV 值大小来看，均明显优于无水乙醇或50%乙醇。这可能是无水乙醇浓度过高，快速固定而致固定不均匀，细胞发生脱水，发硬易碎，样品的碎片增加，DNA 的释放又导致细胞间黏连加大从而使分析结果出现偏差，而50%乙醇由于固定不充分也影响实验结果。在乙醇加入方式的研究中，先将细胞团块用1 mL PBS 重悬后，无论是加入3 mL 预冷无水乙醇混匀还是无水乙醇加入悬液混匀，分析结果均无差异。细胞沉淀不用PBS 重悬直接加入乙醇可能因为细胞没有迅速分散而结团、细胞固定不佳导致分析结果偏差。在染色时间的研究中，染色的初始阶段因染料的结合未充分而影响了细胞周期中各期细胞百分比值，尤其是对S 期和G2/M 期的影响，经过1 h 左右染色基本充分，各期数值在12 h 内变化不大。乙醇固定时间的长短对细胞周期的各期细胞数百分比影响不明显，因此可以收集不同时期处理的样品置-20 ℃保存，待收集完毕后同时上机检测，以减少实验误差。流式细胞上样的速度对分析结果影响显著，由于流速的增加导致样品流液柱直径变大，有部分细胞通过激光束时偏离光斑中心，受到激发的能量下降，信号减弱，表现为直方图的峰增宽，CV 值增大，数据可信度下降。因此流式检测细胞周期一定要低速上样。试剂说明书推荐染色合适的细胞浓度为2×106/mL，本研究用5 倍量的细胞染色发现样品的结果偏差较大，有可能是染色不充分导致。细胞浓度过低时对结果影响不明显，但大大增加了样品的收集时间而影响实验的效率，若加大上样速度又影响实验分析的结果，因此染色前对细胞的计数显得尤为重要，建议最后一遍PBS 重悬细胞用流式细胞仪简单计数细胞，再离心去除PBS 加入合适量的染液。最后由于PI 染料黏附管路对仪器的性能影响较大，表现为CV 值的增大，因此每次检测结束的清洗和定期的大维护也显得非常重要。

综上所述，建议在仪器设备状态良好的前提下，推荐采用先将细胞沉淀用PBS 重悬成单细胞悬液，然后缓慢加入3 倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀打散细胞后置于-20 ℃固定24 h 以上，按每1×106个细胞加0.5 mL 染液室温避光染色1 h 以上，以低流速上样检测为最佳选择。