尿毒康通过抑制p38/ERK MAPK通路改善UUO大鼠肾小管细胞上皮-间质转化*

江茜 ，王宏 ，王蕾 ，康利 ，李燕林

（1．天津市医药科学研究所，天津 300020；2．中山市中医院，中山 528400）

近年来，慢性肾脏病（CKD）的发病率呈上升趋势，CKD常合并贫血、骨代谢异常、心血管并发症等多种并发症，严重影响患者的生理状态和生活质量，并增加患者的死亡风险[1-2]。肾纤维化是CKD的主要病理改变，是由肾小球硬化和肾小管间质纤维化之间的不平衡，细胞外基质（ECM）合成过多引起[3]，包括肾小球硬化（GS）、肾间质纤维化（TIF）和血管硬化。其典型病理表现为肾小球内固有细胞数量减少、细胞外基质过度沉积、肾间质成纤维细胞增生及间质毛细血管丧失[4]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一种胞浆内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在真核细胞中，由4条平行的信号转导通路组成，即细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和应激活化蛋白激酶（SAPK）通路、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路和细胞外信号调节蛋白激酶5（ERK5）/大丝裂原活化蛋白激酶1（BMK1）通路[5]。最新的研究发现，ANGPTL2通过MEK/ERK/Nrf-1途径调节自噬并影响糖尿病性肾病肾纤维化的进展[6]。Roscovitine通过重组人转化生长因子-β（TGF-β1）/p38MAPK途径减轻糖尿病小鼠的肾间质纤维化[7]。

中医中药在预防和治疗CKD中发挥日益重要的作用[8]。百日草（RDP）通过经典和非经典的转化生长因子TGF-β信号转导途径改善了单侧输尿管结扎法（UUO）诱导的肾纤维化[9]。清肾补阳方通过抑制上皮间质转化（EMT）和Wnt/β-Catenin途径减轻5/6肾切除大鼠的肾纤维化[10]。芪丹地黄汤通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）途径减轻糖尿病肾纤维化[11]。肾康注射液可减轻阻塞性肾病中的肾小管间质纤维化[12]。当归芍药散通过调节缺氧和自噬减轻肾脏纤维化[13]。黄葵胶囊通过抑制NOD样受体热蛋白结构域3（NLRP3）炎性小体和激活Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号传导，减轻糖尿病肾病的肾小管EMT，抑制肾纤维化[14]。尿毒康是中山市中医院自主研发的中药制剂，从1992年开始即以汤剂在临床中使用。该药由大黄、丹参、黄芪、红花、地榆等药物组成，黄芪益气健脾为方中主药，配伍红花、丹参活血化瘀，大黄泻浊逐瘀以通肾络，地榆凉血解毒，诸药相合，扶正祛邪，攻补相宜。尿毒康针对慢性肾功能衰竭湿浊内留，气虚血瘀的本虚标实之病机，具有祛湿浊，通肾络，益气健脾的功效。动物实验发现尿毒康合剂能够降低慢性肾功能衰竭大鼠的血清肌酐（SCr）和尿素氮含量，调节脂质代谢，改善肾功能[15]。临床试验发现，尿毒康能降低患者SCr水平，改善肾功能，延缓终末期肾病发展[16-19]。尿毒康能增强机体的排毒能力，减轻肾损伤改善肾功能衰竭[18，20]。然而，尿毒康改善肾纤维化的具体机制至今没有研究。因此，文章通过单侧输尿管结扎法，构建大鼠肾纤维化模型，考察尿毒康改善肾纤维化的机制。

1 实验方法

1.1 UUO复制肾间质纤维化模型 大鼠体质量（208．60±6．05）g，45 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，右侧卧位固定于手术台上，剪毛后用碘酊-75%乙醇消毒手术区，行左侧腹切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露并分离左侧输尿管，手术线结扎两道，然后在两道结扎点间剪断输尿管，逐层缝合。假手术组仅切开腹腔，游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。

1.2 分组及给药 将UUO大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、阳性药对照组（氯沙坦钾片，30 mg/kg，10 mL/kg，相当于临床给药剂量的6倍）、尿毒康20 mL/kg组、10 mL/kg组和5 mL/kg组（分别相当于临床给药剂量的12倍、6倍和3倍）。手术第2天开始给药。假手术组和模型组灌胃给予等体积纯净水，每日1次，连续21 d。各实验组大鼠10只。实验过程中模型组死亡大鼠2只，尿毒康高剂量死亡大鼠3只，低剂量死亡大鼠1只。假手术组、阳性药对照组、尿毒康中剂量组未见死亡大鼠。

1.3 尿液和血清生化检测 末次给药后，收集大鼠24 h尿液，测定24 h尿蛋白。45 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，检测SCr水平。

1.4 组织病理学观察 取结扎侧肾脏（左侧），纵向剖开，10%中性甲醛固定，制成石蜡切片。苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠肾组织的病理改变。Masson染色观察纤维化程度。Masson染色后，显微镜下观察，随机选取10个视野，按病变面积占该视野的百分比评分，无计0分、小于25%计1分、25%～50%计2分、大于50%计3分。

1.5 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TGF-β和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达 取肾脏组织剪碎后加入1 mL Trizon后反复吹打，使样本充分裂解。加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置2min。4℃12000r/min离心15min，离心半径8cm，取上层水相层。加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。4℃12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。4℃12 000 r/min离心5 min，离心半径8 cm，弃上清，挥干。加入30 μL无RNase的水溶解。根据HiFiScript g DNA Removal cDNA Synthesis Kit（康为世纪，Cat：CW2582M）说明书配制反应体系，42℃15 min，85℃5 min逆转录为cDNA。根据 UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪，Cat：CW2601M）进行实时定量反应：预变性95℃5 min，（变性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 1 min，延伸 72 ℃30 s）45 cycles，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。2-ΔΔCt计算 mRNA 的相对变化。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.6 Western Blot检测p38，ERK蛋白的表达 取肾脏组织，磷酸盐缓冲液（PBS）洗净，加入蛋白裂解液，充分裂解后，4℃12 000 r/min离心15 min，离心半径8 cm，取上清液，蛋白定量，变性后进行SDSPAGE电泳。电泳结束后，甲醇活化PVDF膜，按滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序组装；组装完成后按PVDF膜在正极，凝胶在负极，置于转膜槽中，200mA恒流转2h。5%脱脂奶粉室温闭1h。一抗p38（CST，1∶1 000），ERK（CST，1∶1 000），β-actin（CST，1∶1 000），4 ℃孵育过夜。1×TBST 洗3次，每次5min；二抗（HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体，1∶3 000），室温2 h，洗膜，ECL成像系统发光显影，采用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22．0软件进行统计学分析，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿毒康能改善UUO大鼠的肾功能 对各组大鼠24 h尿蛋白含量进行检测，发现与假手术组相比，UUO模型大鼠 24 h尿蛋白明显升高（P＜0．01），见图1A；与模型组相比，阳性药对照组和尿毒康组较UUO模型大鼠 24 h 尿蛋白定量水平（P＜0．05 或 P＜0．01）明显降低，其中尿毒康10 mL/kg组下降明显。随后，检测了大鼠SCr的变化，发现模型组SCr水平明显升高（P＜0．01），见图 1B；与模型组相比，阳性对照组和尿毒康组SCr水平明显降低（P＜0．01）。说明尿毒康能够改善UUO大鼠的肾功能。见图1。

2.2 尿毒康能明显改善肾脏纤维化 大体观察发现：假手术组肾脏大小正常，表面光滑，切面见肾实质厚度正常，皮髓质分界清晰，未见肾盂、肾盏扩张；模型组肾脏体积增大，成囊状，肾切面可见实质菲薄，皮、髓质分界不清，肾盂和肾盏高度扩张、变形。尿毒康各剂量组和阳性药对照组肾脏体积增大较模型组小，肾盂和肾盏高度扩张、变形程度轻。肾组织HE染色发现：假手术组肾小球体积未见缩小或肥大，数目未见减少，肾小管上皮细胞未见变性、坏死或脱落，管腔中未见管型及结石，肾间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；模型组肾小管广泛萎缩及代偿扩张，部分区域可见肾实质细胞明显减少，多数肾小囊增宽，并出现部分肾小球的崩解，大多数肾小管萎缩，上皮细胞变性坏死，局部管腔扩张明显，髓质区失去放线结构，伴有大量炎细胞浸润。尿毒康各剂量组和阳性药对照组病理表现较模型组肾小球形态、肾小管形态、肾间质、炎细胞浸润方面有所改善。其中尿毒康10 mL/kg组在间质纤维化程度方面改善相对明显。见图2A。

Masson染色发现：模型组肾间质增宽、间质成纤维细胞大量增生，胶原纤维形成。半定量分析显示模型组肾间质纤维化程度明显高于假手术组（P＜0．01）；尿毒康10mL/kg组能够明显减轻UUO大鼠肾间质纤维化程度（P＜0．01）。见图 2B 和 2C。

随后，qRT-PCR检测了纤维化关键因子TGF-β和α-SMA的mRNA的表达，发现UUO模型大鼠TGF-β，α-SMA mRNA表达增加，而尿毒康组较UUO模型组TGF-β，α-SMA mRNA表达表达下降。以上结果表明尿毒康能够明显改善肾纤维化，且尿毒康10 mL/kg作用最明显。见图2D。

2.3 尿毒康抑制p38/ERK MAPK通路改善肾纤维化 为了进一步研究尿毒康改善肾纤维化的机制，检查了MAPK通路关键蛋白p38，ERK的表达，发现UUO模型大鼠p38，ERK的表达增加，而尿毒康组较模型组p38，ERK表达下降。说明尿毒康改善肾纤维化可能与抑制了p38/ERK MAPK通路有关。见图3。

3 讨论

图1 尿毒康对UUO大鼠肾功能的影响Fig.1 Effect of Niaodukang on renal function of UUO rats

图2 尿毒康对UUO大鼠肾脏纤维化的影响Fig.2 Effect of Niaodukang on renal fibrosis significantly of UUO rats

图3 尿毒康对MAPK通路的影响Fig.3 Effect of Niaodukang on MAPK pathway

中医学中没有肾纤维化的病名，但从肾纤维化形成的病理基础来看，其与血瘀证密切相关，具体为脏腑功能虚损，脾肾虚为主，兼有浊毒内阻，病情逐步发展而加重，最后导致正气虚衰，浊邪阻滞。研究发现，清肾补阳方[10]、芪丹地黄汤[11]、当归芍药散[13]等在防治肾纤维化方面具有显著的效果，显示了中医药在治疗肾纤维化应用中的良好前景。尿毒康由大黄、何首乌、女贞子、黄芩等药组成，具有益气温阳，健脾益肾，活血泻浊的功能，切中慢性肾功能衰竭脾肾气（阳）虚为本，湿浊瘀血为标的病机。大黄具有泻湿浊、逐瘀血、荡涤胃肠、清热解毒之功效，此外，大黄还具有抗菌，抗凝，降血黏，改善氨基酸、脂质代谢，抑制肾小球系膜细胞等作用，故大黄长期以来用于慢性肾功能衰竭的治疗。丹参中的成分Magnesium Lithospermate B能提高肾组织活性氧清除酶活性，抑制过氧化脂质丙二醛（MDA）的产生，从而改善肾小球滤过、肾小管重吸收功能。丹酚酸A通过抑制NF-κB和p38 MAPK信号通路来减轻5/6肾切除大鼠的肾脏损伤和炎症[21]。丹参和红花协同活瘀血、通肾络，增加尿量，加速毒素从尿中排泄。黄芪具有健脾益气，扩张血管，改善肾血流，促进蛋白质合成的作用。诸药合用，具有化瘀解毒、利湿泻浊、健脾益气功效。本实验首先通过单侧输尿管结扎，成功复制了大鼠肾纤维化模型，通过灌胃给与不同浓度的尿毒康，证实了临床等效剂量的尿毒康能够明显改善UUO大鼠的肾小管细胞上皮-间质转化。在进一步的机制探讨中发现，尿毒康能够降低TGF-β的表达，TGF-β为肾纤维化进展的重要因子。已有研究发现TGF-β上调ERK途径，导致肾小管细胞胶原沉积和肾纤维化[22]。于是通过Western Blot检测了p38与ERK的表达，发现模型组p38与ERK表达增加，尿毒康组p38与ERK表达下降。p38与ERK是MAPK通路的关键蛋白，p38 MAPK通路为控制炎性反应最主要的MAPK家族成员之一，可被TGF-β激活，参与应激条件下的细胞凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎性反应过程。本实验发现给予尿毒康后，p38与ERK表达降低，MAPK通路抑制，因此，尿毒康能够通过抑制p38/ERK MAPK通路改善肾小管细胞上皮-间质转化的肾纤维化。但是尿毒康能否改善其他脏器的纤维化，扩大尿毒康的临床应用仍需进一步的研究。