双硫仑抗癌作用研究进展

刘程林子, 吴耀钦, 黄恩泽, 徐瑞丰, 郑鹏,2*

1.武汉科技大学生命科学与健康学院, 武汉 430065;2.武汉科技大学生物医学研究院, 武汉 430065

根据世界卫生组织2020年度报告数据显示,每年死亡人数中超过六分之一是由癌症导致，癌症已成为全球第二大死因。随着人们生活环境受到的污染越来越多，生活节奏逐渐加快，暴露在致癌因子下的几率大大增加，人类癌症的发病率逐年上升[1-2]。癌症的恶化原因是细胞不受控制异常生长，如果这种异常现象持续下去，可能导致肿瘤的增长和转移，使死亡风险升高。由于癌症对人类健康构成巨大威胁，几十年来研究者们一直在使用各种方式来防止癌症的增殖和扩散。在癌症的初期诊疗中，治疗方案通常包括手术切除原发灶及其邻近淋巴组织、放疗或化疗等[3]。然而多数情况下这些方法并不能完全消除癌细胞，也会造成部分正常组织细胞的损伤，给患者带来更多伤害。鉴于此，一些能清除肿瘤细胞同时避免正常细胞受到损害的特异性抗癌药物引起了科学研究者的广泛关注[4]。

双硫仑(安塔布司)是一种能够抑制肝醛脱氢酶的活性从而治疗酒精依赖的药物[2]，于1951年被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)正式批准临床使用[5]。20世纪70年代，研究人员在动物实验中发现双硫仑可以减缓肿瘤的生长速度并且杀死肿瘤细胞。1993年，一项针对乳腺癌患者的临床试验清晰证明了双硫仑可以抑制癌症发展并延长患者的生存期。目前双硫仑已过专利期，使用专利的成本大大减少，而且它在临床使用中报告的不良反应极少，用药风险很低[6-7]。根据大量实验验证以及上述优势，双硫仑正在被发掘作为一种新的抗癌药物。迄今为止，研究得出参与双硫仑治疗癌症的相关机制包括以下几点：蛋白酶体系统；肿瘤干细胞；肿瘤转移机制和细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)等[5, 8-11]。虽然双硫仑的抗癌能力高，优势突出，但是它也有缺点，比如稳定性较差，在体内代谢迅速，血浆半衰期仅4 min，这些问题使其临床适用性受到很大限制。目前研究人员尝试采用各种措施来消除这些缺点的影响，包括使用特殊材料封装双硫仑、将双硫仑搭载于新型纳米材料以及提高双硫仑利用率等[12-13]。另一方面截至目前，双硫仑抗癌机制的具体情况尚未研究清楚。

本文中，我们首先简单概述了几种最近报道的研究中已经提出的双硫仑抗癌机制，然后讨论了它参与抑制癌症发展不同阶段起到的作用，最后总结了双硫仑药物应用的最新进展以及双硫仑联合多种药物治疗常见癌症的潜在机会，以期为双硫仑在抗癌药物中的应用研究提供参考。

1 双硫仑抗癌的分子机制

1.1 双硫仑能够抑制乙醛脱氢酶活性

双硫仑在体内的代谢产物对乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)有抑制作用，1950年起就作为一种治疗酒精依赖的药物而被广泛使用[14-15]。在后来癌症研究的进程中，人们发现ALDH与癌症的发展密切相关[16]：高表达的ALDH作为一种肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)的标志物在多种恶性癌症中均出现异常水平的表达，比如肝癌、骨癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌等。目前越来越多的证据表明，ALDH在肿瘤干细胞的增殖中起重要作用，高水平的ALDH有提高癌细胞持续增殖的能力，同时能够促进原发肿瘤中癌细胞的生长[17-18]。最初人们认为双硫仑是ALDH的抑制剂，后来实验结果表明，双硫仑并不直接抑制人细胞类型的ALDH活性，是其体内的代谢产物S-甲基-N，N-二乙基硫代氨基甲酸酯亚砜(S-methyl-n, n-diethylthiocarbamate sulfoxide, DTC)抑制ALDH活性[19]。研究人员在实验中分别使用了ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛(diethylaminobenzaldehyde, DEAB)、含铜和无铜双硫仑处理卵巢癌细胞后检测ALDH水平，结果显示双硫仑对ALDH的抑制效果比DEAB要高，含铜离子的双硫仑则比单独的双硫仑具有更强的抑制效果[10, 20-22]。而且由于双硫仑对ALDH的抑制效果是不可逆的，所以尽管肿瘤干细胞在短期治疗的环境下不一定能被完全杀死，但其细胞干性特征已经被显著的持续性抑制[23-24]。上述实验结论证实双硫仑能抑制ALDH减少肿瘤干细胞驱动的肿瘤生长进程。

1.2 双硫仑能够提高细胞内活性氧浓度

大量文献证实，活性氧(active oxygen, ROS)参与肿瘤生长发展并起到了重要作用[25-26]。几年前的一些研究表明ALDH是一种ROS清除剂，它具有降低氧化应激和保护干细胞免受其毒害作用的能力[27]，结合之前一些关于ALDH的实验结果可以推测：双硫仑-铜复合物可以通过抑制ALDH起到减少ROS的清除效果，实验结果也证实双硫仑处理使ROS的浓度迅速升高，以此抑制肿瘤干细胞的发展[28-29]，同时诱导癌细胞凋亡[30]。这种情况下，癌细胞内ROS浓度提升，会导致DNA损伤、细胞周期异常和细胞凋亡等[31]，而且上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)进程也会受到抑制[32]，这一系列影响使得双硫仑的抗癌特性显著。双硫仑通过提高细胞内ROS浓度杀死癌细胞的这一发现为双硫仑作为抗癌药物的应用打下基础。

1.3 双硫仑能够调节NF-κB活性

细胞核因子kappa-B (nuclear factor kappa-B, NF-κB)蛋白参与调节细胞凋亡，它是一种和免疫反应密切相关的蛋白，同时它还与肿瘤的发生、生长和转移密切相关[33]。2003年的一项实验指出,双硫仑可以抑制NF-κB蛋白活性，抑制上皮间质转化[34]。之后实验证实双硫仑通过抑制蛋白酶体26S来抑制NF-κB蛋白活性[35]：双硫仑抑制NF-κB核转移和Smad4的表达，介导转录因子Snail和Slug的下调，以此抑制NF-κB信号转导，从而影响EMT的进程[36]。2014年的一项研究结果显示双硫仑可以通过抑制NF-κB活性并且下调ERK/NF-κB/Snail通路来逆转肿瘤干细胞的转化。上述多个研究结果均证明NF-κB不止和EMT有相关性，还影响肿瘤干细胞，因此双硫仑可以作为一种双重抑制剂：它既可以抑制上皮间质转化来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，也可以通过抑制癌症干细胞的干性特征抑制其生长[37]。另一项实验的结果显示，在酸性环境中双硫仑/铜复合物能更有效地下调NF-κB蛋白水平[38-39]，而肿瘤微环境正是一种偏酸性环境，这更有利于双硫仑在肿瘤组织中发挥作用。

1.4 双硫仑作为蛋白酶体抑制剂的抗癌作用

蛋白酶体途径是细胞中将蛋白质合成中错误折叠或者其他蛋白质降解的主要途径。已有实验报道，双硫仑可以有效抑制蛋白酶体活性，诱导乳腺癌细胞凋亡，并且从实验中人们发现，双硫仑可以靶向蛋白酶体，减少天然肿瘤抑制蛋白(如p27和Bax等)的降解，使其积累起到抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，这可能是双硫仑能有效抗癌的原因之一。由于双硫仑会与铜离子螯合形成复合物，而癌组织的铜离子水平较正常组织偏高，因此双硫仑可以通过螯合铜离子靶向聚集在肿瘤组织以达到抑制肿瘤细胞蛋白酶体活性的效果，诱导肿瘤细胞凋亡[7]。抑制蛋白酶体起到抗癌效果的这一方向有极大的应用潜力，适合进一步探索该方法的具体机制开展应用研究。

1.5 双硫仑靶向NPL4产生抗癌作用

NPL4是一种双硫仑作用于肿瘤抑制的分子靶标，同时也是p97分离酶的衔接因子，它是多种蛋白质和应激反应途径的关键环节，特别是由于癌细胞的代谢速度异于正常细胞，就更加依赖NPL4/p97途径降解剩余的废弃蛋白质。2017年Skrott等[40]提出了一种双硫仑的抗癌机制：双硫仑作用于NPL4来抑制NPL4/p97途径降解蛋白起到抗癌的作用。该文章指出，双硫仑体内代谢产物与铜离子形成的复合物CuET促进NPL4蛋白凝结并与p97蛋白紧密结合，使癌细胞内p97降解蛋白质的功能受到影响，导致大量废弃蛋白在胞内聚集，最终诱导癌细胞凋亡。已有实验数据证实双硫仑的代谢产物与铜离子形成的复合物CuET，在肿瘤细胞中聚集并且麻痹p97/NPL4依赖蛋白，导致蛋白质发生未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction, UPR)和热休克反应(heat shock response, HSR)。这些毒性应激反应改变了癌细胞内p97依赖蛋白的降解过程。总的来说，双硫仑通过阻止细胞处置废弃蛋白达到消除癌细胞的目的[41]，而且双硫仑体内代谢产物可以通过靶向蛋白酶体上游的NPL4蛋白来抑制蛋白酶体/poly-Ub蛋白降解途径[42]。虽然NPL4/p97通路对正常细胞新陈代谢也很重要，但由于肿瘤组织中的铜含量比正常组织高，双硫仑和铜离子的螯合作用使其对肿瘤组织具有天然趋向性，它的代谢产物也会主要集中在肿瘤组织，可减少对正常组织的伤害，这一特点正是双硫仑的临床应用潜力巨大的原因之一。

1.6 双硫仑抑制DNMT活性

DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)在细胞中催化甲基转移至基因启动子的CpG岛，它在癌细胞中高度活跃，直接导致癌细胞中与肿瘤抑制相关的基因表达异常。用DNMT抑制剂抑制DNMT活性可以使肿瘤抑制相关蛋白重新表达。在正常细胞中，DNMT1蛋白水平是受到严格控制的，其中在细胞周期G1期蛋白水平最低。但是在癌细胞中严格受控的DNMT1蛋白水平被破坏，癌细胞整个细胞周期内DNMT1蛋白水平的稳定性增加，持续保持高水平[43]。之前的实验研究中发现双硫仑通过催化半胱氨酸巯基反应抑制ALDH[44]，因此人们推测双硫仑可能通过类似方式影响半胱氨酸来干扰DNMT1的催化活性。之后的研究证明了这一推论，双硫仑确实可以作为DNMT抑制剂：双硫仑通过抑制DNMT1作为DNA去甲基化剂，从表观遗传学上调控癌细胞蛋白的表达[45]。由此可以预测未来双硫仑通过表观遗传治疗癌症的策略是有可行性的。

1.7 双硫仑上调免疫原性细胞死亡

免疫原性细胞死亡(death of immune prototypical cells, ICD)是指在药物刺激下细胞从非免疫原性细胞向免疫原性细胞的转化过程，它能在体内引发抗肿瘤免疫作用[46]。免疫原性死亡的肿瘤细胞在表面分泌多种细胞因子并表达多种信号分子刺激免疫细胞识别和攻击其微环境中的肿瘤细胞，例如将树突细胞(dendritic cells, DC)募集到肿瘤病变组织并促进其免疫功能。同时，它通过募集和激活抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)来产生肿瘤特异性T细胞应答，达到消除肿瘤细胞的效果[47]。实验结果显示，双硫仑可以通过上调位于细胞膜表面的ICD相关分子CRT蛋白的表达水平作为ICD诱导剂。因为CRT在介导肿瘤细胞的ICD中起着非常重要的作用，并且它是在细胞膜表面高表达的膜内蛋白，所以它可以被APC识别为细胞毒性标记物[9]。双硫仑处理后细胞CRT蛋白水平增加，这意味着它可以募集更多特异T细胞来攻击肿瘤细胞并利用免疫原性抗癌作用发挥作用。这一机制显示双硫仑除了药物的直接作用外，还可以通过调节免疫系统参与抗癌作用。

2 双硫仑在药物中的应用进展

2.1 双硫仑和顺铂联合用药

顺铂是一种用于治疗癌症的非特异性一线抗癌药物，它具有细胞毒性，通过与核DNA结合引起交联破坏DNA的功能，从而干扰正常DNA复制机制[48]。它在癌症化学疗法的治疗中起关键作用，是临床上用于癌症治疗的常用药物。然而由于长期用药，肿瘤细胞通常对顺铂产生耐药性，一些肿瘤细胞甚至对顺铂不敏感，而且顺铂毒性较大导致其对正常细胞产生损伤，研究人员一直在寻找可以与顺铂联用以提高药效的药物。双硫仑可以通过抑制ALDH的活性来靶向抑制细胞系中的肿瘤干细胞生长，研究人员尝试用双硫仑和顺铂联合应用来治疗乳腺癌，他们发现双硫仑的参与提高了顺铂的特异性[10]，双硫仑与顺铂对乳腺癌细胞的协同作用很好地解决了乳腺癌细胞顺铂耐药的问题。同时由于双硫仑的参与，顺铂的利用效率明显提高，使它可以在较低浓度下产生相同的抗癌效果。在临床治疗中，减少顺铂的使用能够减轻对正常细胞的损伤。而且在相同剂量的顺铂治疗下，双硫仑对ALDH不可逆的抑制效果可延长药物有效时间并延长治疗时间。双硫仑与顺铂的作用机制不同，两种药物联合使用可起到双途径抗癌作用[21, 49-50]，这一应用具有广阔的发展前景。

2.2 双硫仑和DHA联合用药

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是大脑皮层、中枢神经系统和视网膜的重要组成部分。研究人员通过大量实验证实，DHA具有杀死肿瘤细胞的能力，而且其衍生物产生的毒性更大，杀死癌细胞的能力更强。根据这一特性，DHA现已被用作临床辅助治疗癌症的抗癌药物[51-52]。但是由于大多数抗癌药物在杀死癌细胞的同时对正常细胞也有毒性，因此迫切需要与其一起使用毒性较小的抗癌药物。研究人员分别用双硫仑和DHA处理肿瘤细胞，发现与单独的双硫仑和DHA相比，用双硫仑和DHA共同处理可以诱导更多的癌细胞死亡并且可以抑制体外和体内肿瘤的生长。针对其抗癌机制的研究表明，双硫仑能有效增强DHA诱导的细胞氧化应激，同时DHA能够增强双硫仑诱导的癌症模型中肿瘤干细胞的抑制，表明肿瘤干细胞的抑制是由双硫仑和DHA的联合产生的抗癌作用[53]。DHA和双硫仑可以产生协同效应以更有效地杀死癌细胞，这种协同作用通过增强细胞氧化应激和抑制癌细胞干性以达到抗癌目的，未来针对这两种药物的联用可以进一步提高DHA作为抗癌药物的效果。

3 双硫仑在医药材料中的研究进展

双硫仑抗癌效果较好且成本低、毒害低，但也存在缺点：在生理条件下双硫仑极不稳定，如酸性胃环境中双硫仑会快速降解，抗癌的有效成分容易失效，而且双硫仑的血浆半衰期低于4 min，在体内代谢速度快，这使得双硫仑有效发挥作用的时间非常短[12]。因此，研究人员认为有必要采用特殊方法处理双硫仑以延长其在体内的作用时间。纳米材料技术近几十年来稳步发展，对于药物开发是一个不错的选择，而且它已广泛应用于多种类型药物的制药应用，其中也包括癌症治疗药物[54-60]，它也是提高不溶性药物溶解度和生物利用度最常用的方法之一。聚合物纳米粒子(polymer nanoparticles, NPs)对新型药物传递系统(drug delivery system, DDs)的显著优势在于其优异的生物相容性、传递效率和生物利用率等。聚合物纳米粒子的主要优势是它们的纳米级尺寸，它可以进入或注入细胞膜、血管及血管壁等身体不同部位的通道，运送药物到其目标部位[61]。根据这一特点，研究人员考虑将双硫仑装载到纳米粒子上。由于纳米粒子特殊理化特性和胶体稳定性，装载其上的双硫仑在体内的稳定性增强，并可以通过内吞作用进入癌细胞后释放药物产生药效。针对体内和体外癌细胞的相关实验证实，装载于聚合物纳米离子的双硫仑比游离药物有更强的抗癌作用[62]。然而由于专利问题，传统常用的纳米材料技术成本一直较高，这使得纳米材料装载药物的成本增加[62]。2018年Chen等[42]提出了一种制备纳米粒子的新方法，该方法考虑到双硫仑的代谢产物是发挥抗癌作用的关键，因此将金属离子铜与双硫仑的代谢产物Cu(DDC)2的复合物直接用于制备药物。Cu(DDC)2-NPs在血清中的稳定性可长达72 h，制备完成的药物纳米颗粒也可在室温下储存至少1个月。该方法简便有效，可生成药物浓度高、负载效率高且理化性质理想的Cu(DDC)2-NPs，解决了双硫仑在抗癌治疗中的转运传递问题。此外，有研究人员将双硫仑、顺铂与2个纳米粒子一同结合制成纳米药物，将联合用药和纳米材料两种策略结合，大大提高了药物的使用效率[50]。

4 展望

一直以来，癌症都是医学界备受关注的重点。现代医学中的传统治疗方法并不能完全治愈，而且对患者的身体心理以及经济条件都是极大的考验。而新药的开发一般需要大量的成本和时间、多次临床试验，而且还需要相关部门的严格审批才能进入市场，过程繁琐。目前，研究人员大多考虑从已获批准的药物中寻找抗癌药物，并对其抗癌机制展开研究。

双硫仑的抗癌机制非常复杂，目前的研究结果显示这是由于多种途径同时起作用：①双硫仑在体内的代谢产物抑制肿瘤细胞ALDH产生；②抑制癌细胞内ROS清除途径使其大量积累而导致细胞损伤；③抑制NF-κB信号转导影响细胞增殖；④抑制蛋白酶体并在癌细胞中积累废弃蛋白质以诱导细胞凋亡；⑤通过促进NPL4蛋白的凝固和结合来调节细胞内蛋白质的降解，从而对p97蛋白起到降解作用；⑥抑制DNMT的功能，DNMT作为DNA甲基化水平调节的重要组成，被抑制后增强肿瘤抑制水平；⑦诱导进行ICD，刺激T细胞攻击癌细胞，并通过调节免疫系统参与来增加抗癌作用等。这些机制本身都是正常细胞中存在的代谢途径，双硫仑代谢产物螯合铜等金属离子的特性使其具有抗癌趋向性，使这些调节作用更多发生在铜离子含量高的肿瘤组织中，从而提高双硫仑对肿瘤细胞的特异性。这正是目前研制抗癌药物所追求的：产生抗癌效果同时避免损伤正常细胞。

联合用药是目前临床用药的常用方法。顺铂是临床治疗中常用的化学治疗剂之一，作为广谱抗癌药物，顺铂通过与DNA结合而引起交联从而破坏DNA的功能，扰乱细胞周期并抑制细胞的有丝分裂。为了提高特异性，将顺铂和双硫仑共同装载到纳米颗粒上用于联合治疗，当双硫仑-顺铂纳米颗粒进入人体时，双硫仑的代谢产物螯合铜离子，作用于肿瘤组织，同时可将顺铂带入肿瘤组织。实验研究还发现，双硫仑可以提高顺铂的疗效，在双硫仑的作用下，较少的顺铂也可以发挥良好的抗癌作用，这意味着药物毒害作用的降低。此外，双硫仑在人体内的稳定性差，装载到纳米颗粒后，微粒通过内吞作用进入细胞后，大大降低了药物在体内运输中的损失。

作为一种临床使用数十年的药物，双硫仑的许多优点使其具有新型抗癌药物的巨大潜力，如①无毒；②疏水性足以穿过血脑屏障，可作用于脑肿瘤，可应用范围广；③几乎不可能诱发肿瘤；④专利期已过，成本较低；⑤有专门定位肿瘤的趋势，并且与其他药物具有协同活性等。以上特点让其有潜力成为一种优秀的抗癌药物。

本综述总结了双硫仑在抗癌能力和应用方面的研究进展。尽管目前对双硫仑的了解仍然不够全面，但基于某些分子机制的研究来开发应用也是可行的。双硫仑通过多种机制参与癌症的治疗过程，多种途径共同作用使其成为一种有前景的药物。另一方面，双硫仑的药物制备细节在很大程度上影响治疗效果，通过对双硫仑的特殊处理和与其他抗癌药物的组合使用可以改善治疗效果。本文探讨了双硫仑的研究以及其抗癌治疗的具体机制，为双硫仑的抗癌作用研究和未来的临床应用奠定了基础。