基于CRISPR/Cas9技术构建点突变小鼠概述

刘素丽 朱 云 武会娟

(1. 北京实验动物研究中心有限公司，北京 102609)(2. 国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院 感染与病毒研究室，北京 100045)

虽然利用小鼠胚胎干细胞技术进行基因修饰的原理至今仍然适用，但CRISPR/Cas9技术的出现或者技术使得在小、大鼠和其它物种中构建基因工程模式生物更加容易[1-2]。Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，在特定基因组位点产生DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，随后DSBs通过易错的非同源末端连接(Non-Homologous End-Joining，NHEJ)和高保真同源介导修复(homology-directed repair，HDR)机制进行修复。NHEJ可导致插入或缺失(insertions or deletions，InDels)，利用此修复方式可以通过一个sgRNA在靶基因编码区引入移码突变或通过两个sgRNA删除关键外显子或转录调控元件，从而构建基因敲除(Knock-Out，KO)小鼠模型；HDR是当供体模板存在时，能够产生精确的基因修饰，因此被用来构建敲入(Knock-In，KI)小鼠模型，但是效率较KO低。根据文献得知，KI中引入的模板序列可以是单链寡聚核苷酸(single-stranded DNA oligonucleotides，ssODN)[3-4]，也可以是带有长同源臂的双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)[5-6]。ssODN适用于向靶位点引入短片段如小的融合标签(HA、Flag、V5)或点突变，而dsDNA则主要用于引入长片段如大的标签或荧光标记(GST、GFP、mCherry)。但dsDNA作为修复模板容易发生随机整合(尤其是线性dsDNA)，并且其会对细胞产生毒性。Ghanta等[7]研究得到，相较于dsDNA，ssODN具有更高的修复效率。

点突变小鼠是转录因子结合、磷酸化位点功能分析和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作用检测的重要体内研究工具。通过将Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN共同注入小鼠受精卵可高效制备点突变小鼠。本文将重点概述利用CRISPR/Cas9系统和ssODN供体构建点突变小鼠的方法，例如sgRNA和ssODN的设计及体外转录、受精卵显微注射、子代鼠基因型鉴定等。

1 sgRNA和ssODN的设计

1.1 sgRNA的设计

设计sgRNA之前，考虑到SNP会影响Cas9的结合和切割，因此应扩增靶位点附近片段，并将靶片段的Sanger测序结果与GenBank中的参考序列进行比对确认靶位点附近是否存在SNP。随后将靶序列导入在线网站CRISPOR web tool(http://crispor.tefor.net/)设计sgRNA，并使用在线网站Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)预测潜在脱靶位点。由于还没有一种预测工具能够保证sgRNA的效果，通常选择设计多个sgRNA，并利用体外切割实验和细胞内切割实验来验证多个sgRNA的有效性，最终选择效率较高的sgRNA进行后续受精卵注射。

1.2 ssODN的设计

获得KI小鼠的成功率依赖sgRNA的特异性和效率，但更大程度上依赖供体ssODN的设计，其同源臂长度、对称性、方向等均影响HDR效率，原因如下：①同源臂长度一般为40～80 bp[8-12]。不同研究中所使用的同源臂最优长度不一致[13-17]，但供体总长度需在200 bp以内，否则合成难度增大且价格较高。但也有研究利用长ssDNA(single-strand DNA)成功实现点修复和长片段的敲入[18-22]；②通常对称ssODN效率最高，即Cas9切割位点位于中间，并且选择距离突变位点最近的sgRNA(少于20～25 bp)[23]进行。有研究证明相较于对称供体，非对称供体介导的HDR效率更高[10, 16, 24]；③与sgRNA互补的ssODN效率更高[10, 25]，但并未在所有位点观察到这种链偏好[24]；④为了避免Cas9切割供体以及修饰后的靶序列(突变位点在sgRNA序列及PAM外)，在供体的前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列NGG或PAM近端的sgRNA序列引入一个同义突变[12](NGG不能突变成为能被Cas9识别的NAG)；⑤引入上述同义突变后，确保靶基因的氨基酸序列不变，特别是突变位点位于外显子和内含子交接处。总之，可能由于不同研究中所使用的细胞系、靶位点等不同ssODN的设计有所差异。

2 sgRNA和Cas9的体外转录及活性检测

携带由T7启动子驱动的Cas9基因的质粒可用来体外转录产生Cas9 mRNA[26]是一种无需连接反应的PCR方法，也可作为体外转录产生Cas9 mRNA的模板[12]。sgRNA可以利用质粒或PCR产物进行体外转录[26]。另外，一种无需克隆而是利用共享一段重叠区域的两个长寡核苷酸进行重叠PCR后的产物也可以作为sgRNA的体外转录模板[27]。向胚胎注射有活性的sgRNA对于基因编辑的成功非常重要，利用小鼠细胞进行活性检测是很好的方法，但需要考虑转染效率。体外切割实验，即在转录得到sgRNA后，Cas9重组蛋白诱导包含靶位点在内的PCR片段，产生双链断裂(DSB)。体外切割实验也可以用来检测sgRNA活性，但无法保证检测到的sgRNA在体内仍然具有活性。

3 受精卵显微注射

将Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN共同注射入受精卵可以对小鼠胚胎进行高效的基因组编辑。原核RNA注射和胞质RNA注射产生的整体编辑效率相当。由于原核注射对胚胎的损害更大，因此胞质注射产生的活仔更多，并且胞质注射更方便和更简单。Singh等[2]和Yang等[12]采用了不同注射方式及不同注射浓度，但均证实较HDR NHEJ效率更高。其介导的InDels采用胞质注射时，在较高的Cas9 mRNA(100 ng/μL)和sgRNA(50 ng/μL)注射浓度时，产生的大部分胚胎也是健康的。由于ssODN需在核内发挥作用，因此HDR介导的修复采用原核显微注射或者在原核注射退针时进行胞质注射，效果可能会更好。

4 子代鼠基因型鉴定

考虑到多个位点同时突变以及基因型嵌合的存在，表型分析之前需要进行详细的基因分型。多种分型策略已应用到CRISPR/Cas9介导的基因修饰小鼠的鉴定。最常用的SURVEYOR核酸酶可以检测并切割野生型链和包含InDels的扩增子链形成的异源双链分子，从而确定是否发生编辑；通过PAM或sgRNA识别位点内限制位点的丢失/获得或者PCR扩增子在凝胶电泳中可辨别的大小变化来判断是否发生编辑。但以上两种方法均无法确定突变的准确序列。由于存在两个或多个不同的等位基因，直接Sanger测序扩增子也存在问题。因此，可以将PCR产物克隆入质粒载体，挑取足够数量的单克隆进行Sanger测序，但这种方法费时而且可能无法覆盖所有等位变异，尤其是无法覆盖嵌合体。另外一种方法是利用深度测序，对PCR扩增靶片段进行分析，同时检测潜在脱靶位点，但二代测序中使用小片段扩增子，因此无法检测到某些片段的缺失/修饰。以上鉴定方法各有优缺点。对于本文概述的点突变和小的标签插入，可以通过扩增靶位点附近的序列并将PCR产物与T载体连接，挑取数个单克隆进行Sanger测序，从而获得所有基因型，但对于较大的插入或缺失，则需要进行侧翼PCR(flanking PCR)和Southern blot实验。

5 局限性

CRISPR/Cas9系统的主要局限是可能产生脱靶，但已检测到的大量脱靶是基于细胞实验，而小鼠胚胎中CRISPR/Cas9诱导的基因编辑是高度特异的[8-9]。产生上述差异的原因可能是胚胎注射实验中，由mRNA表达的Cas9蛋白是瞬时的，而细胞转染实验中由质粒产生的Cas9蛋白表达时间更久。另外，使用永生化细胞系或癌症细胞系进行脱靶分析，无法代表正常细胞中的脱靶情况。此外，经过几代育种筛选后，脱靶突变也可能逐渐消失。为降低脱靶几率，控制Cas9和sgRNA的表达时间，如使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物来实现基因编辑[28-30]，RNP复合物在导入后12～24 h内即可切割染色体DNA，并且Cas9蛋白在24～48 h内会迅速降解[31]。另一种降低脱靶的策略是使用Cas9切口酶(Cas9n)[32]的“双切口”策略，即利用一对sgRNA在靶位点的两条链分别产生一个切口，随后在供体存在时进行HDR介导编辑。由于单切口的脱靶位点可以进行无突变修复，而只有双切口的靶位点才能产生后续编辑。因此双切口靶位点可显著提高基因编辑的特异性[26, 33]。另外，全基因组深度测序也是检测子代鼠是否存在脱靶的一种策略。

向受精卵显微注射Cas9 mRNA/sgRNA构建基因修饰小鼠的另一个弊端是通常会产生嵌合体动物。嵌合体使基因和表型分型更为复杂，因此，需要经历长时间的繁育纯化过程。为降低嵌合率及脱靶现象，既可以通过直接递送Cas9蛋白而非RNA或借助一种名为Past-CRISPR的方法(parental allele-specific gene-targeting)，即利用原核互换显微操作技术介导的胞质稀释作用时空特异性地控制Cas9的编辑活性[35]。

6 小结

利用CRISPR/Cas9技术构建的点突变小鼠具有极大的科研和临床价值，能够助力多种疾病的机制研究[36-38]。本文对点突变小鼠构建的一般流程进行综述，希望能为基于CRISPR/Cas9技术构建点突变小鼠实验提供一定的理论参考。