SD 大鼠老龄化过程中外周血及免疫细胞表型的性别差异研究

管博文卢延华白 琳石桂英苏路路王玉全魏 强王 卫孟爱民

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

中国在逐步步入老龄化国家,衰老的研究日趋重要。 进入老年后,免疫系统逐渐发生改变,患炎症疾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤的风险也随之上升。 老龄化疾病的发生及转归具有明显的性别差异,对衰老发生过程中性别差异的机制受到研究者的关注[1-2]。 SD 大鼠属于封闭群动物,在遗传多样性方面更接近人群,基因,毒理和代谢与人类很接近,封闭环境和固定的饮食排除了其他干扰因素,为研究衰老过程中的性别差异提供了动物模型[3-4]。

我们在前期研究中比较了自然衰老大鼠与青年大鼠外周血、免疫分型以及P16 表达的差异[5]。本文在前期工作的基础上,比较分析不同月龄SD大鼠在上述各项指标中的性别差异为衰老和老龄化比较医学研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

使用SPF 级SD 大鼠,8 周龄雄性 5 只、雌性5只,体重范围分别为 265 ～ 285 g 和 199 ～ 205 g。 12月龄 SPF 级SD 大鼠雄性10 只,雌性10 只,体重分别为 720～970 g 和 360 ～490 g。 所有大鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004]。 在中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境下饲养[SYXK(京)2018-0002],屏障内温度保持在20℃～26℃,保障屏障内相对湿度为40%～70%,内部压力大于外部压力10 Pascal,屏障内照明亮度15～20 lm/m2且每隔12 h 昼夜交替一次。 经过医科院动研所伦理审查委员会的批准(IACUC MAM17001),动物福利依照3R 原则,保障取食饮水等自由[5]。

1.2 主要试剂与仪器

外周血荧光抗体CD4-APC(201509)、CD45RAAPC ( 202313 )、 CD161-FITC ( 205608 ) 购 于BioLegend;CD11b-PE(Mac,MA5-17512)、CD8 PECy7(25 - 0084 - 80) 购于 Thermofisher scientific;CD25-PE(MA1-80772)、CD3-FITC(MA1-81619)购于eBioscience;脾淋巴细胞荧光抗体CD3-FITC(201403)、CD45RA-APC(202313)购于 BioLegend;eBioscienceTM1×RBC Lysis Buffer 购于 Thermofisher scientific Invitrogen(00-4333-57);大鼠T 细胞富集试剂盒购于STEMCELL Technologies(EasySepTMRat T Cell Isolation Kit,#19641);ficoll 分离液购于Solarbio Life Sciences(大鼠脾单个核细胞分离液试剂盒,P4870);全自动血液分析仪 PentraDX120(ABX);BD 流式分析仪(BD FACSAria II)。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血细胞计数及分类

使用戊巴比妥钠按照60 mg/kg 进行腹腔注射,麻醉。 腹主动脉取血,抗凝,进行血计数分类检测[6]。

1.3.2 免疫脏器指数

取大鼠大脑、胸腺和脾称重,按照下述公式计算胸腺指数和脾指数。 免疫脏器指数=脏器重量(g)/大鼠大脑重量(g)。 因性别和月龄的差异,大鼠体重差异较大,故采用脏脑比[7-8]。

1.3.3 外周血免疫细胞分型检测

取50 μL 外周血,加入 1 mL 红细胞裂解液,室温条件下裂解8 min 后离心5 min,条件1500 r/min,4℃。 沉淀,弃上清,保持每个样本 100 μL 体系,加入抗体,条件 4℃,避光,孵育 30 min。 2 mL PBS 洗一遍,离心条件不变。 加入300 μL PBS 过滤到流式管中,上机检测[5]。

1.3.4 脾淋巴免疫细胞分型检测

制备脾细胞悬液。 每个样品取50 μL 进行检测。 其余步骤同1.3.3。

1.3.5 脾T 细胞分离及P16 mRNA 表达量检测

将剩余脾细胞悬液,用ficoll 分离单个核细胞,EasySepTMRat T Cell Isolation Kit 富集 T 细胞。 按照1×106～5×106/mL 的细胞浓度加入 TRIzol,提取总RNA,保存在-80℃。 交由上海欧易生物医学科技有限公司采测定P16 mRNA 的表达量[9]。

1.4 统计学方法

数据处理和绘图利用软件GraphPad Prism 6,计量资料数据用平均数±标准差(±s)表示。 利用ANOVA 检验和t检验进行组间差异分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血细胞计数及分类性别差异比较

外周血细胞计数结果显示,青年雌性大鼠白细胞计数(white blood cell,WBC)低于雄性(P>0.05),老年大鼠雌性比雄性低48.83%(P<0.01)。 老年组大鼠与青年组大鼠同性别之间比较有降低趋势,但未见统计学差异。

红细胞(red blood cell,RBC)计数结果青年组未见性别差异。 老年组雌性比雄性下降了9.38%(P<0.05)。 但与青年雄性组和青年雌性组相比,对应性别的老年组,均有明显上升(P<0.01,P<0.05)。

外周血白细胞分类结果显示,青年组和老年组中性粒细胞(neutrophilic granulocyte,NE)百分比未见性别差异。 但是相同性别中,老年组比青年组有明显的升高,其中老年雄性组比青年雄性组上升了60.58%(P<0.01),老年雌性组比青年雌性组上升了23.81%(P<0.05)。

青年组和老年组淋巴细胞(lymphocyte,LY)百分比未见性别差异。 但是相同性别中,老年组比青年组有明显的降低。 其中,老年雄性组比青年雄性组下降23.06%(P<0.01),老年雌性组比青年雌性组下降了14.26%(P<0.05)。

青年组及老年组嗜酸性粒细胞(eosinophilic granulocyte,EOS)百分比结果未见性别差异。 但是老年雄性和雌性大鼠对应青年雄性和雌性大鼠均有明显上升,分别升高了88.16%和121.53%(P<0.05,P<0.01)。

老年组与青年组单核细胞(monocyte,MO)百分比比较未见差异,青年SD 大鼠未见性别差异,老年雄性大鼠MO 高于老年雌性大鼠95.83%,具有性别差异(P<0.05)。

血红蛋白(hemoglobin,HGB) 浓度、血小板(platelet,PLT) 计数和嗜碱性粒细胞(basophilic granulocyte,BAS)百分比三项结果老年组与青年组比较、性别比较未见差异。 结果如表1 所示。

2.2 免疫脏器指数

青年大鼠胸腺指数未见性别差异。 老年雌性大鼠与老年雄性大鼠比较降低43.09%,具有性别差异(P<0.01)。 与青年雌性大鼠相比,老年雌性大鼠降低36.27%(P<0.01)。 提示老年雌性大鼠出现了胸腺指数下降。 青年SD 大鼠脾指数未见性别差异。 老年雄性组高于老年雌性组46.28%,有性别差异(P<0.01)。 和青年雄性组相比,老年雄性组上升了31.34%(P<0.01),提示老年雄性大鼠脾指数明显上升。 结果如图1 所示。

表1 老年大鼠与青年大鼠外周血细胞计数及分类性别差异比较Table 1 Sex difference of peripheral blood cell counts between aged and young rat

注:A:胸腺指数;B:脾指数。 a:与青年雄性大鼠相比;b:与青年雌性大鼠相比;c:与老年雄性大鼠相比。图1 老年大鼠与青年大鼠脏器指数性别差异比较Note.A, Thymus index.B, Spleen index.a, Compared with young male rat.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 1 Sex difference of organ index between aged and young rat

2.3 外周血免疫细胞分型

流式分析外周血门的设置参考之前的研究[5]。外周血免疫细胞分型结果显示,青年组大鼠各项指标未发现性别差异。

老年组辅助T 细胞(helper T cell,Th)未见性别差异。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠Th 从(27.54 ± 3.34)% 上 升 到 (43.14 ± 6.51)% (P<0.01)。

老年雄性大鼠调节T 细胞(regulatory T cell,Treg)为(3.7±0.93)%,老年雌性大鼠 Treg 为(9.46±4.18)%,有性别差异(P<0.01)。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠Treg 明显升高,分别为(1.7±0.59)%及(9.46±4.18)%,具有明显的统计学差异(P<0.01)。

老年雄性大鼠细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)比例为(7.79±2.26)%,与老年雌性大鼠(16.38±5.6)%比较,有性别差异(P<0.01)。 老年雄性大鼠较青年雄性大鼠,CTL 从(13.72±1.34)%下降到(7.79±2.26)%(P<0.05)。与青年雌性大鼠比较,老年雌性大鼠 CTL 则从(10.1±3.98)%上升到(16.38±5.6)%(P<0.05)。

老年雄性大鼠B 细胞为(36.48±8.09)%,老年雌性大鼠为(26.52±5.38)%,具有明显性别差异(P<0.05)。 相比于青年雌性组,老年雌性大鼠B 细胞从(41.66±9.82)%下降到(26.52±5.38)%,具有明显的统计学差异(P<0.01)。

老年雄性大鼠自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)检测结果为(7.61±3.33)%,老年雌性大鼠(4.82±1.72)%,有性别差异(P<0.05)。 相比于青年雄性组,老年雄性大鼠NK 从(3.97±0.56)%上升到(7.61±3.33)%(P<0.05)。 老年雌性组比青年雌性组有明显的上升,但未见统计学差异。

单核细胞结果中各组大鼠结果分别为(0.19±0.18)%、(0.66±0.3)%、(1.02±0.71)%和(1.00±0.64)%,未见统计学差异。 结果见图2。

2.4 脾免疫细胞分型

老年雄性大鼠脾单个核细胞 CD3 结果为(35.55±6.28)%,老年雌性大鼠(42.81±4.29)%,具有性别差异(P<0.05)。 与青年雌性大鼠相比,老年雌性大鼠从(33.72±3.51)%上升到(42.81±4.29)%(P<0.05);青年雄性大鼠与老年雄性大鼠鼠CD3 结果分别为(37.7±3.54)%和(35.55±6.28)%,未见统计学差异。

CD45RA 结果中各组结果分别为(44.32 ±2.12)%、 (48.52 ± 3.79)%、 (41.3 ± 4.83)% 和(36.08±5.08)%。 相比于青年雌性组,老年雌性组从(48.52±3.79)%下降到(36.08±5.08)%(P<0.01),雌性具有年龄差异。 结果见图3。

2.5 脾T 细胞P16 mRNA 表达量检测

分离大鼠脾T 淋巴细胞,检测P16mRNA 表达量,以 2-ΔΔCt表示。 结果显示,相比于青年大鼠,老年大鼠上升了272.05%(P<0.01),结果见图4。 相比于青年雄性大鼠,老年雄性大鼠上升了232.72%,(P<0.01),老年雌性大鼠比青年雌性大鼠上升了307.57%(P<0.01)。 青年组大鼠及老年组大鼠的P16mRNA 均未见性别差异。

3 讨论

本文进行了青年、老年大鼠外周血计数及白细胞分类、免疫细胞分型、免疫脏器指数及脾细胞免疫细胞分型、脾T 细胞p16 表达水平的检测和性别差异比较分析。 青年大鼠各项指标检测结果未见性别差异。

外周血计数及分类结果显示,老年大鼠表现为WBC 下降,NE%升高,LY%降低,EOS%升高等老龄化改变。 其中WBC 出现性别差异,表现为雌性大鼠WBC 下降更为明显。 在健康老年人群中女性WBC 低于男性[10-11]。 老年大鼠的肥胖可能也是引起WBC 性别差异的诱因之一,在代谢综合征研究中,体重、腰围等指标与WBC 呈明显正相关[12]。 相比于老年雌性大鼠,老年雄性大鼠的体重上升,腹部脂肪增加可能与WBC 高于雌性有关。 老年雄性大鼠的中性粒百分比上升,淋巴百分比下降,发生髓系分化偏移,这是造血系统出现衰老和易发急性髓系白血病的血液学特征[13]。 本文中主要体现为老年雄性大鼠中性粒升高,与老年男性更易患髓系白血病相契合[14]。 与之前未发表的老年C57 小鼠结果进行进行对比发现,EOS%的升高属于老年性改变,暗示着老年人造血系统的紊乱和高发湿疹皮炎等相吻合[15-17]。

注:A:调节T 细胞;B:辅助T 细胞;C:细胞毒性T 细胞;D:B 细胞;E:自然杀伤细胞;F:单核细胞。 a:与青年雄性大鼠相比;b:与青年雌性大鼠相比;c:与老年雄性大鼠相比。图2 老年大鼠与青年大鼠外周血免疫细胞分型性别差异比较Note.A, Helper T cells.B,Regulatory T cells.C,Cytotoxic T cell.D,B cell.E,Natural killer cell.F,Monocyte.a,Compared with young male rat.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 2 Sex difference of peripheral blood immune cell typing between aged and young rat

注:A:CD3+;B:CD45RA+。 b:与青年雌性大鼠相比;c:与老年雄性大鼠相比。图3 老年大鼠与青年大鼠脾免疫细胞分型性别差异比较Note.A, CD3+.B, CD45RA+.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 3 Sex difference of spleen immune cell typing between aged and young rat

注:与青年大鼠相比,∗∗P<0.01。图4 老年大鼠和青年大鼠脾T 细胞的P16 mRNA 表达比较Note.Compared with young male rat, ∗∗P<0.01.Figure 4 Comparison of P16 mRNA expression in splenic T cells between aged female rat and young female rat

免疫细胞分型结果显示,老年大鼠T 细胞比例升高,B 细胞降低。 外周血与脾免疫细胞分型变化趋势一致。 外周血T 细胞分型检测结果显示,老年大鼠CD4 升高,数据显示主要是老年雌性升高所致,但未见性别差异。 老年大鼠CD8、Treg 升高,也是以雌性升高为主,具有性别差异。 雌性激素对Th1 细胞具有抑制作用,对Th2 具有刺激作用;老年雌性大鼠雌性激素水平降低,对Th1 和Th2 的调节作用发生变化,表现为T 细胞比例升高和B 细胞比例下降[18-20]。 调节性T 细胞的上升主要是随着时间的积累而增加,但是雌激素的下降会导致雌性大鼠体内受雌激素激活的T 细胞失去功能[21];所以在老年状态,有些细胞数量增加但功能会减退[22-23]。也有研究认为老年雌性大鼠T 细胞升高和老年女性对疫苗的免疫效力要高于老年男性,同时发生不良反应概率高相吻合[21]。

先天免疫细胞分型结果显示老年大鼠NK 细胞比例升高,雄性高于雌性,有性别差异;老年大鼠单核细胞比例升高,未见性别差异。 在朱丽华的研究中显示,健康中国成年人,大龄组的NK 细胞百分比和绝对值有性别差异,其他各项指标无差异[24]。 与大鼠的NK 和单核细胞比例变化结果一致。

脾T 细胞的p16INK4a 基因表达代表大鼠整个机体的衰老水平。 我们之前的研究中发现,雄性大鼠P16 mRNA 表达水平与衰老程度成正相关[5]。本文检测了雌性大鼠P16 的表达情况。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠P16 mRNA 表达量明显升高。 但老年组内未见性别差异。 说明大鼠中P16mRNA 的表达升高主要与增龄有关,与Liu 等[25]和Melk 等[26]的结论一致。

上述结果显示,老年大鼠出现外周血NE%升高、LY%降低、EOS%升高、脾T 细胞P16 升高等老龄化改变,未见性别差异,提示这些改变主要与增龄有关。 老龄化改变中,WBC,T 细胞和B 细胞这三项,老年雌性大鼠变化更为显著。 青年组大鼠未见明显性别差异,随着月龄的增加和激素的变化,破坏了老年大鼠的免疫系统的内稳态(homeostasis)平衡[22,27],尤其是处于围绝经期的雌性大鼠,雌激素下降,周期紊乱[28],导致免疫系统衰老的进程中出现性别差异。 在今后的老年化研究中,若采用单一性别动物要注意研究结果可能会与实际情况存在偏差。