体外受精-胚胎移植中选择性单胚胎移植的现状及新进展

史蕊，张印峰，张瑶佳，张云山*

(1.天津医科大学，天津 300070；2.天津市中心妇产科医院生殖医学中心，天津 300052)

近年来随着体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)及其衍生技术的不断进步，临床妊娠率显著提高。传统移植策略是双胚胎移植(DET)和多胚胎移植(MET，定义为3个及以上胚胎)，但其代价是多胎妊娠风险很高[1]。美国疾病控制与预防中心(CDC)最新数据显示，2016年辅助生殖技术(ART)出生婴儿的多胎妊娠率是全美出生婴儿的9倍(31.5% vs.3.4%)[2]。多胎妊娠已成为ART最常见且严重的并发症，与之相关的母婴并发症如妊娠期高血压病、胎盘早剥、早产、产后出血、双胎输血综合征、低出生体重儿、胎儿畸形等的发生率均显著高于单胎妊娠，双胞胎和三胞胎的围产儿死亡率分别是单胎的4倍和6倍[3]。因此，在ART治疗过程中，减少多胎妊娠十分必要。大量研究认为单胚胎移植(SET)是避免多胎妊娠的有效途径[4-7]，并提出在特定的人群中实施选择性单胚胎移植(eSET)可以在不影响临床妊娠率的同时显著降低多胎妊娠率。许多西方国家已广泛应用eSET，国内生殖中心也在逐渐增加其使用，但目前国内尚无统一指南。本文将从以下几个方面分别阐述，为今后的临床实践提供参考。

一、eSET应用的现状

美国辅助生殖技术协会(SART)将eSET定义为存在一个以上的高质量胚胎，每周期仅移植一个优质胚胎[1]。1999年，Gerris等[8]对eSET进行了前瞻性临床研究，对预后良好的人群应用eSET，可使不孕夫妇获得与正常夫妇相似的持续妊娠率，并有效降低多胎风险。此后，许多国家纷纷规定或鼓励生殖中心在合适的条件下应用eSET。

1.立法层面：2003年瑞典立法规定除特殊情况外，原则上每个周期只能移植1枚胚胎。同年，比利时法律规定<36岁的女性第1次IVF治疗周期必须行eSET。因此欧洲人类生殖与胚胎学会(ESHRE)2003年的年度报告显示，7个国家共7 155个周期实施eSET，其中比例最高的国家是瑞典(55%)，比利时次之(43%)[9]。2009年英国人类受精与胚胎学会(HFEA)出台政策规定生殖中心常规应用eSET，此后英国多胎妊娠率从2008年的26.6%下降至2013年的16.3%，而IVF/ICSI的活产率并未受到影响[10]。2010年土耳其强制规定，无论胚胎质量优劣，<35岁的女性首次和第2次IVF周期中最多移植1枚胚胎，≥35岁者最多移植2枚胚胎[10]。同样地，加拿大从2010年开始在魁北克省对每个移植周期强制实行SET[10]。

2.指南或共识层面：日本、澳大利亚、芬兰、美国等对eSET的应用没有正式立法。日本妇产科学会和美国生殖医学协会(ASRM)分别于2008年和2013年在临床指南中建议对预后良好的年轻女性应用eSET[9]。美国CDC最新官方数据显示全美eSET应用率在35岁以下女性中为42.7%，35～37岁为25.2%，37岁以上为6.7%[2]。我国专家共识推荐在辅助生殖治疗过程中应用eSET策略[11]，国内多家生殖中心已开展SET，部分中心已获得较好的临床结局[6-7]。

随着各国立法和指南的实施，eSET的应用越来越广泛。由于既往国家ART年度报告中很难区分eSET和SET，2016年国际辅助生殖技术监督委员会(ICMART)对61个国家和地区近2 500个生殖中心的调查显示全球SET比例从2008年的25.7%上升到2010年的30.0%，双胞胎出生率在2008年、2009年和2010年分别为21.8%、20.5%和20.4%[12]，以上结果在不同区域之间差异较大。另一项世界范围的ART趋势调查显示，不仅新鲜周期SET被广泛应用，解冻周期SET应用率也逐年升高[13]。澳大利亚/新西兰地区从2004年的45.3%增长到2013年的84.9%，日本从2007年的55%增长到2012年的80%[13]。虽然国外大多数学者认为eSET是IVF患者的最佳选择，但是基于以下几方面原因，国内临床上广泛应用eSET仍存在一定阻力[14]：(1)患者对双胞胎的偏好和对eSET的诸多顾虑，使其产生抵触心理；(2)目前缺乏判断胚胎发育潜力的有效指标，即使形态良好的卵裂期胚胎也有可能无法培养成优质囊胚；(3)若移植失败，后续助孕治疗会增加额外的经济和时间成本，患者心理负担也会增加；(4)患者对囊胚体外培养和胚胎冷冻技术的安全性还存在担忧等。

国内外专家逐渐认识到，IVF治疗最理想的结局是获得单胎、足月、健康的活产儿，尽量减少双胎妊娠和相关的母婴并发症，eSET是达到此目的最有效的方法[1，11]。近年来，不论是国家立法的强制规定还是指南共识的鼓励建议，各国eSET的应用率逐年升高，并有部分国家倾向于在解冻周期应用。移植策略的转变使全球多胎妊娠率下降，许多北欧国家将多胎妊娠率控制在10%以下，大大降低了新生儿发病率和死亡率[9]。

二、eSET的优缺点

国外许多文献对卵裂期或囊胚期eSET进行了研究，其中规模最大、控制最好的是瑞士一项多中心、双盲、随机对照临床试验(RCT)[4]。该研究将661名年轻女性随机分为eSET组与DET组，98%的患者进行了卵裂期胚胎移植。通过比较发现新鲜周期eSET的多胎妊娠率显著低于DET(0.8% vs.33.1%，P<0.001)；eSET未获活产的患者进行后续解冻周期选择性单胚胎移植(eSFET)后，累计活产率与DET组无统计学差异(38.8% vs.42.9%，P=0.3)。Dobson等[5]对选择性单囊胚移植(eSBT)的前瞻性研究发现，新鲜周期eSBT的临床妊娠率虽显著低于DET(41% vs.51.2%，P<0.01)，但两者活产率相似(33.7% vs.40.8%，P>0.05)。以上研究结果验证了eSET的有效性。Cochrane的系统评价[15]通过对多项RCT统计发现，在单次IVF周期中eSET的活产率显著低于DET[OR=0.48，95%CI(0.39，0.60)，高质量证据]；但经过连续2次eSET(无论2次新鲜周期eSET还是eSET+eSFET)的累计活产率与DET相比，并没有显著降低[OR=0.82，95%CI(0.62，1.09)，低质量证据]。目前推荐大多数IVF患者实施多次eSET移植策略，但高质量证据仅限于预后较好的年轻患者。既往有回顾性研究发现在40岁以上的患者中实施eSBT，可获得与DET相似的临床妊娠率[33% vs.33%，OR=1.04；95%CI(0.62，1.75)]和活产率[20% vs.22.8%，OR=1.43，95%CI(0.78，2.64)]，提示eSBT在高龄人群中的应用似乎是可行的[16]。加拿大学者对两种方案RCT的临床妊娠结局进行Meta分析发现，eSET的早产率[RR=0.37；95%CI(0.25，0.55)]和低体重儿出生率[RR=0.25；95%CI(0.15，0.45)]显著低于DET，且两者的围产期死亡率、早期流产率等之间无显著差异[17]。既往大量的回顾性或随机临床研究在不同年龄人群中证明，eSET可获得不劣于DET的累计活产率，可有效降低多胎妊娠的风险，从而改善母婴不良结局，且不会使患者早期流产的风险增加。

但实施eSET并非没有缺点。1.临床因素：虽然玻璃化冷冻技术已经很成熟，但仍有部分胚胎可能在冻存和升温后无法存活(据报道有3%～12%左右)[18-19]。尽管如前所述，许多研究认为eSET可以显著降低多胎妊娠率[4-7]，但并不能完全消除多胎妊娠。据Vega等[20]报道，eSET后多胎妊娠风险约为0～2%，与单胎妊娠相比，同性双胎妊娠中新鲜移植周期比例更高，即新鲜周期移植更有可能造成同性双胎妊娠[76.5% vs.69.8%，OR=1.4；95%CI(1.02，1.95)，P=0.03)]。在符合DET条件的IVF患者眼中，eSET充其量是一次不必要的尝试且成本高昂，它可能使患者延迟获得成功妊娠，且多次宫腔操作有可能导致移植失败[21]；2.社会因素：有学者提出双胎妊娠是IVF-ET中可以接受的并发症[21]。部分患者对双胎的偏好甚至凌驾于安全之上。国外一项问卷调查显示，大多数(58.2%)不孕不育夫妇更愿意一次生育双胞胎[22]；3.经济因素：所有风险都必须与收益相平衡。Hernandez等[23]利用前瞻性临床实验结果分别对eSET+eSFET与DET进行了成本效益评估，发现两组持续妊娠率分别为38.6%和42.2%，每个病人的平均花费分别是5 614.11欧元和5 562.29欧元，因此连续两次eSET在效益和成本方面并未优于DET。虽然eSET的广泛应用逐渐成为全球趋势，但其在所有年龄段或所有IVF患者中的全面应用及其成本收益仍有待探讨。

三、eSET的适用人群

在IVF/ICSI-ET过程中应用eSET的益处显而易见，但选择合适的患者仍是临床医师的一大挑战。根据美国SART与ASRM的指南[24]，以下情况推荐应用eSET：1.经PGS筛选后移植整倍体胚胎的任何年龄患者；2.年龄<38岁，符合以下任何一项的患者：(1)有可用的冻存优质胚胎；(2)经IVF治疗后获得活产；(3)有可用的冻存囊胚期胚胎；(4)首次FET。3.供卵移植周期中年龄<35岁的受卵者；4.其他可能因多胎妊娠增加严重并发症的患者。国内专家结合国情还建议对既往有双胎妊娠、早产或剖宫产史者及计划生育二胎者应用eSET[11，14]。

四、eSET的胚胎筛选

评估胚胎质量是eSET成功的关键，选择最有可能植入的胚胎可以缩短成功妊娠时间。过去十年，胚胎筛选方法有了很大改进，不仅仅依靠静态形态学评估。多种鉴别和筛选优质胚胎的方法(如延时成像、植入前遗传学筛查和代谢组学等)也逐渐应用于临床[25]。

1.胚胎形态学：传统上，筛选最有植入潜力的胚胎主要根据不同发育阶段的胚胎形态学特征。一项大型前瞻性研究显示，卵裂期胚胎卵裂球数目、单核卵裂球的比例和碎片程度对预测活产具有独立预测价值[26]。优质卵裂期胚胎往往具有以下特点：受精后第2天有4～5个卵裂球，第3天至少有7个卵裂球，无多核且细胞碎片<20%[27]。

然而有证据表明，基于形态学标准选择第2或第3天的优质胚胎可能并不准确，导致移植的胚胎在后期出现发育异常或停滞，因此部分患者需要囊胚培养与移植。囊胚的质量分级主要根据囊胚扩张程度、内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)的情况进行评价。Bakkensen等[28]评估了上述三个参数对单囊胚移植(SBT)临床妊娠和围产期结局的重要性。多元logistic回归分析显示，除ICM外，囊胚扩张程度和TE均与临床妊娠和活产相关。此外，囊胚形成时间是胚胎生长速率的体现，形态学评分相似而形成时间不同的冷冻胚胎植入率差异显著，胚胎生长速率明显落后于该有的发育阶段说明胚胎发育潜能差[27]。根据以上评分标准，理想的囊胚应该是在第5天发育为4AA级囊胚，第6天的胚胎评分应该≥5AA[27]。

2.延时监测技术(Time-lapse monitoring Technology，TLT)：TLT是将显微摄像装置安装在胚胎培养箱内，以固定频率对胚胎进行自动摄像[29]。它是一种无创方法，使胚胎学家无需将胚胎从培养箱中取出就可以评估胚胎质量，保证了胚胎培养环境的稳定性[29]。国外一项Meta分析显示，应用TLT筛选胚胎对妊娠结局有显著益处，可使临床妊娠率[OR=1.54，95%CI(1.21，1.97)]和活产率[OR=1.67，95%CI(1.13，2.46)]显著升高，使早期流产率显著降低[OR=0.66，95%CI(0.47，0.94)][30]。而最新的Cochrane系统综述对9项RCT进行分析发现，TLT在改善临床妊娠率[OR=0.95，95%CI(0.78，1.16)]和活产率[OR=1.12，95%CI(0.92，1.36)]方面的证据并不充分[31]。况且该装置成本非常高，胚胎实验室使用该技术会产生额外的固有成本，还需对实验室人员进行专业培训等，故ESHRE专家推荐临床上应用TLT进行胚胎筛选之前，临床工作者要从经济、可操作性等方面充分评估其利弊，选择合适的评估系统和形态动力学参数等[29]。

3.植入前遗传学筛查/植入前非整倍体筛查(PGS/PGT-A)：PGS/PGT-A使临床医生可以在移植前评估胚胎的非整倍性(即染色体数目异常)，近十年来被逐渐应用于eSET胚胎筛选[32]。在生殖医学领域，有多种分子技术用于确定胚胎染色体倍性，包括荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交(CGH)、阵列CGH(aCGH)、数字聚合酶链反应(dPCR)、单核苷酸多态性(SNP)、实时定量PCR(qPCR)和下一代测序(NGS)等[32]。Simon等[33]对3 934枚囊胚使用SNP方法进行染色体倍性分析，发现经PGS筛选后eSBT与DET的胚胎种植率(69.7% vs.70.3%，P=0.95)、临床妊娠率(68.6% vs.81.9%，P=0.25)和活产率(61.7% vs.77.6%，P=0.14)之间无显著差异。Dahdouh 等[34]对多项RCT分析后发现PGS可显著改善临床妊娠率[RR=1.29，95%CI(1.15，1.45)]和持续妊娠率[RR=1.39，95%CI(1.21，1.60)]。但ASRM的专家认为此种方法仍存在多处不足，如遗传分析造成额外的时间和经济成本、部分胚胎无法培养至囊胚期进行检测、活检导致胚胎损害、医源性非整倍体以及结果不准确性造成健康胚胎的浪费等[32]。Somigliana等[35]对PGT-A的成本效益分析指出，在具有活检技术和能力的大型诊疗中心，对35岁以上女性使用PGT-A筛选胚胎才是划算的。因此，PGT-A为所有IVF患者筛选胚胎的价值还有待确定。

4.代谢组学：代谢组学是利用色谱法、光谱法及质谱法等技术对某一生物或细胞所有低分子量代谢最终产物(代谢物)进行定性和定量分析，可用于评估不孕女性的卵母细胞质量、胚胎活力和子宫内膜容受性等[36]。它可以反映基因表达下游的事件，并提供其他“组学”技术无法提供的细胞内新陈代谢的相关信息[25]。有学者比较近红外光谱技术与常规形态学评分发现，代谢组学预测妊娠结局更准确[37]。Liang等[38]发现利用拉曼光谱法对废弃胚胎培养液进行胚胎染色体倍性分析，可达到95.9%的准确率，预测效果与PGT-A一致。Iles等[39]在移植前通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)可以简单、直接、快速地分析胚胎移植时囊胚培养液的消耗，从而快速识别出最佳胚胎。但Cochrane的系统综述认为目前没有证据支持或反驳胚胎植入前代谢组学在ART中的应用[36]。因此，今后需要更多、更有力的研究对胚胎代谢组学进行评估，并探讨其对妊娠结局的影响。

胚胎筛选方法随着新技术的发展有了很大改进，特别是不再仅仅依赖静态的形态学评估。TLT的应用使胚胎学家能够在胚胎培养不受干扰的情况下，对胚胎的发育情况进行评估。从理论上来说，PGS/PGT-A最有可能筛选出整倍体优质胚胎，改善IVF治疗的成功率，但目前的证据不足以支持其在胚胎筛选领域的全面应用。非侵入性的代谢组学技术可能会作为胚胎形态学评估的补充方法，提高胚胎筛选的准确性。胚胎筛选经典又普遍适用的方法是形态学评估，其他新方法在成为ART常规技术之前，必须进行安全性、效益、成本等方面的研究[25]。

总体来说，eSET的应用在全球范围内有增加趋势，且解冻周期eSET的应用率逐渐升高。大量研究表明，连续多次eSET可以保持良好的成功率，同时对降低多胎妊娠有明确作用，因此现行政策对预后良好的患者推荐这一移植策略。但目前阻碍eSET普遍应用的因素依然存在，如患者的受教育程度、经济水平、胚胎筛选及胚胎体外培养和冻融技术的安全性等。今后在临床工作中需进一步评估eSET对不同年龄及不同预后女性的影响，不断完善其适应症并加强患者宣教，选择准确高效的胚胎筛选方法，推动eSET的临床应用。