乳制品中食源性致病菌检测技术研究进展分析

赵国婧，谢国阳，肖芳斌，姜华祥，许恒毅*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，330047，南昌；2.南昌市青云谱区市场和质量监督管理局个体私营经济协会办公室，330001，南昌；3.南昌市青云谱区检验检测中心，330001，南昌)

0 引言

乳制品营养丰富，是人类膳食中蛋白质、钙、磷、维生素A和维生素B2的重要来源。最近几年，随着国民经济水平的持续进步，我国人民的生活质量逐步提高，国内的家庭膳食层次已经普遍地改善了，对于乳制品消费水平呈现明显的上升趋势。目前普遍的乳类品种主要包含液态乳、粉态乳和其他种类乳制品。由于乳制品营养丰富，极易被微生物污染，成为其生长繁殖的营养介质。在所有发生的大规模乳制品安全事件中，大部分是由致病菌污染所引起的乳制品中毒事件。乳制品污染后的食源性致病菌主要包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌等，金黄色葡萄球菌，因其广泛存在于自然界中，可以通过乳制品加工人员、加工过程、运输过程等途径污染乳制品，造成乳制品腐败变质；沙门氏菌是一种引起细菌性食物中毒的重要致病菌，生鲜乳中少量的沙门氏菌就可能导致感染，引发沙门氏菌病等；克罗诺杆菌又称阪崎肠杆菌，是奶粉中最常见的食源性致病菌，婴幼儿是该菌感染的高危人群且感染后致死率较高，因此对其预防和检测尤为重要。本文介绍了常见致病菌的检测方法，并重点介绍了基于核酸的检测方法，以期为乳制品中食源性致病菌的检测提供参考。表1总结了不同的检测方法在致病菌分析测定中的应用。

表1 不同的检测方法在致病菌分析测定中的应用

1 基于培养的检测方法

目前国家标准对于乳制品检测有详细的检验方法和限定范围，如GB 4789.18—2010《乳与乳制品检验》[1]、GB 4789.4—2010《沙门氏菌检验》[2]、GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》[3]、GB 4789.40—2010《阪崎肠杆菌检验》[4]等。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度以及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，这些特征包括菌落的形状、颜色等方面，因此可以通过观察菌落的形态特征对微生物种类进行判断。这些基于细菌培养的检测方法都可以从样品中得到致病菌定性和定量的检验结果，但都需要经过样品处理、增菌、分离、生化鉴定等过程，具有操作简单、成本低、准确度高等优点，却也存在周期长、操作复杂、鉴定微生物种类有限等缺点，难以满足市场需求。因此出现了一些特异性更好、检测更快速灵敏的致病菌检测技术。

2 基于分子生物学技术的检测方法

随着分子生物学技术的发展，已经有多种核酸检测方法应用于食源性致病菌的检测。如经典的聚合酶链式反应(PCR，Polymerase chain reaction)，该技术具有灵敏度高、特异性强的特点。Rahn[6]等根据沙门氏菌的侵袭蛋白A(invasion protein A，invA)基因设计引物,用PCR技术对沙门氏菌进行了检测，共检测了630株沙门氏菌和21个属的142株非沙门氏菌，准确率为99.4%。但PCR技术需要核酸扩增仪作为辅助工具，对操作人员技术水平要求较高，因而在实验室之外的应用有一定局限。近年来核酸等温扩增技术逐步发展，以环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)、重组酶等温核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、重组酶介导的等温核酸扩增(Recombinase Aided Amplification，RAA)、依赖核酸序列的扩增(Nuclear Acid Sequence-based Amplification，NASBA)为主的一类核酸技术逐渐应用于食源性致病菌的检测，同样具备一定的应用前景。

2.1 环介导等温扩增技术

环介导等温核酸扩增技术是一种目前较新的DNA扩增方法，其可以针对靶基因上的特异性区域设计引物，从而利用Bst DNA聚合酶在恒温条件下完成对靶基因的大量扩增，具有灵敏度高、特异性强等优点，但也容易污染，出现假阳性问题。该技术已广泛应用于细菌类病原微生物检测、病毒类病原微生物检测、病原寄生虫检测、转基因产品检测等领域。关玉婷[7]等以沙门氏菌肠毒素stn基因为靶基因设计引物，应用DNA聚合酶链置换活性和羟基萘酚蓝(HNB)在LAMP反应中颜色变化特征，建立了可视化LAMP检测技术，其灵敏度可达1.55×10-8ng/μL，实现了原料乳中沙门氏菌的检测。林芳明[8]等发明了不耐热型产肠毒素，即大肠埃希菌的LAMP快速检测方法，结果显示，此方法能够准确地从生鲜牛乳中检测到1 pg当量的产肠毒素大肠埃希菌的DNA，且与其他类型的大肠埃希菌及细菌不发生交叉反应，检测所需时间约1 h，具有特异性强、敏感性高、快速的特点，对保障生鲜牛乳食品安全有十分重要的意义。程晓艳[9]等根据副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列设计引物，建立了LAMP快速检测技术，结果表明，该细菌的DNA最低的检出限是35.5 fg/反应管，该方法的灵敏度比PCR高10倍，只需约45 min左右完成。同时利用此方法对扇贝样品中的副溶血弧菌进行检测，结果显示，此LAMP方法对检测致病性的副溶血弧菌安全、可靠。

2.2 重组酶等温核酸扩增技术

比如重组酶等温核酸扩增技术是一种体外恒温核酸扩增新技术。该技术主要模仿T4噬菌体内的核酸复制机制[10]依赖重组酶UvsX[11]与Gp32单链结合蛋白在体外的恒温环境下实现DNA模板特异性结合和识别，同时通过链置换DNA聚合酶Bsu实现了模板DNA的扩增。此方法检测优点是时间短、操作方便、灵敏程度高，缺点是该技术对某些特定的短序列核酸无法检测。该技术在食源性病毒、食源性致病菌、动物源性成分检测等方面均有广泛应用。高建欣[12]等建立了一种RPA与乳胶微球试纸条(Latex Microsphere Test Strips，LMTS)相结合的方法，根据金黄色葡萄球菌的基因nuc保守区序列设计特异性的引物，经过RPA的扩增，完成了金黄色葡萄球菌快速检测，其灵敏度为1.2×102CFU/mL。刘立兵[13]等依照志贺氏菌侵袭性质的粒抗原H基因(ipaH)保守区序列的设计和exo探针，建立了志贺氏菌实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的检测方法。该方法特异性扩增志贺氏菌，在39 ℃恒温下20 min即可完成检测，检测的灵敏度为3.5×10-3ng/μL，该方法在人工污染样本中的检测时间仅需7—12 min。GAO[14]等建立了一种快速检测沙门氏菌的RPA-LFD检测方法，在30～45 ℃下，只需要8 min的扩增就可达到相关扩增子的检测阀值，该方法特异性强并且灵敏度高。RPA技术可以为食源性的致病菌检测提供一类快速且简便的方案。

2.3 重组酶介导的等温核酸扩增技术

重组酶介导的等温核酸扩增技术也是一种恒温扩增方法，与RPA不同的是，RAA扩增法利用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37 ℃的恒温环境下，该重组酶可以和引物的DNA紧密结合，形成酶与引物的复合体，当引物不断在模板的DNA上搜寻到和它完全互补的序列时，并且在单链DNA的结合蛋白辅助下，展开模板DNA的内部双链结构同时使引物和模板相配对，随后在DNA的聚合酶作用下，组成了新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。该技术用时少，操作简单，已广泛应用于微生物检测、医学检测等领域。张小平[15]等人按照沙门菌的invA基因来设计引物与探针，并且采用重组酶介导核酸扩增方法对沙门菌进行快速检测。结果显示，建立的方法在39 ℃下进行，检测时间在20 min以内，检测下限为102copies/μL。魏莹[16]等建立了RAA技术用于溶血性链球菌的检测，检测时间小于20 min，灵敏度为10 copies/μL，具有良好的特异性。

2.4 依赖核酸序列的扩增技术

依靠核酸相关序列的扩增技术是一类扩增RNA的新技术种类，依靠一对特异性引物来介导的，并且以3种酶来催化的，以单链RNA为模板等温扩增[17]。该技术具有操作简单、灵敏程度高、特异性较强的特点，已广泛应用于多种病毒的检测当中，但仍然还存在假阳性、灵敏度低等问题，需要进一步优化改进反应条件。杨蜜[18]等人设计了一对具有隐球类菌属特异性的引物，并且建立了NASBA扩增隐球菌的RNA方法，结果表明该方法灵敏度可达10 CFU/mL。钟响[19]等人按照金黄色葡萄球菌的核酸酶nuc1基因设计相关的引物，进行了NASBA检测，同时采用了人工添加菌来污染样品进行验证。结果显示，实验中未出现假阳性和假阴性结果，灵敏度高，检出限达到4 pg/μL的总RNA；检测时间短，24 h即可完成样品中目标菌的筛选，非常适合口岸快速检出金黄色葡萄球菌。

2.5 核酸交联染料相结合等温扩增技术

等温扩增技术来检测乳制品中致病菌方法是具有灵敏度高、特异性强、快速便捷等优点的方案，已广泛应用于食源性致病菌的检测。然而，细胞死亡后，由于DNA分子能保留较长时间，从样品中提取的死菌DNA同样能作为模板进行特异性扩增，因此检测过程中难以区分“死菌”和“活菌”容易出现假阳性结果[20]。核酸交联染料即含有2个或2个以上烷基化官能基团的烷基化试剂，核酸染料可以通过受损的死菌细胞膜，在特定光激活后与DNA结合，从而抑制DNA扩增，这样可以消除死菌的影响。GAO[21]等食品中的活的但不可培养的副溶血性弧菌(VBNC)进行检测时发现：当VBNC菌浓度小于104CFU/g时，PMAxx处理样品后结合qLAMP法与qPCR比检测结果更精确。减少了普通核酸检测在食品中VBNC微生物含量低的情况下，可能导致的假阳性结果。

3 基于免疫学技术的检测方法

在1959年，研究者yalow和Berson同时将发射性同位素示踪方法和免疫反应相结合创建了现代的发射免疫测定法，从而开创了免疫分析这一崭新领域，免疫学技术发展至今，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点[22]，已经在微生物相关的检测方面取得了广泛的应用。免疫学技术的主要原理是抗原与相应抗体，无论在体内或体外相遇，均可以发生各种抗原抗体反应，包括中和反应、沉淀反应或溶解反应等，由于特定抗原(抗体)的量与反应的强度呈现明显的函数关系，可以依此对样品进行定性或定量的分析，主要包括酶联免疫吸附技术、免疫层析技术、酶联荧光免疫分析技术等。

3.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)的基本原理是将可溶性抗原或抗体吸附到某种固定载体表面，采用添加酶标的抗体或抗原，产生抗原和抗体反应，从而形成抗原抗体的复合物，经过洗涤后，游离的酶标抗体和抗原被冲洗掉，然后再加入酶底物和载体上的抗原抗体复合物相结合进行免疫酶染色，通过定性或定量分析有色产物量就可确定样品中的待测物质含量。周鹤峰[23]等构建了阪崎肠杆菌的特异性抗体相关间接ELISA检测方法，最后确定37 ℃显色10 min，检测灵敏度达到102CFU/mL，该检测方法具有高效快速、特异性强等特点，为食品中的阪崎肠杆菌的相关检测创立了研究基础。胡金强[24]等人选用金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因作为靶标，采用地高辛来标记引物扩增的PCR产物和用生物素标记的探针进行杂交，然后与ELISA平板上的链霉素杂交，通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术，应用结果表明采用PCR-ELISA技术来检测人工污染金黄色葡萄球菌的牛奶检测敏感性为101CFU/mL，比普通PCR检测的敏感性(103CFU/mL)高100倍，实验全过程只需要5—6 h。该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性，能够特异、敏感、准确地检测牛奶的金黄色葡萄球菌。

3.2 酶联荧光免疫分析技术

酶联荧光免疫分析技术ELFIA(Enzyme-Linked Fluorescent Immunoassay)是在酶联免疫吸附技术基础上发展创立的用酶系统和荧光免疫分析相互结合的微生物的快速检测方法。它利用理想的荧光底物来代替显色底物，使得分析灵敏度显著提高，从而达到扩大测量范围和减少试剂用量的目的。刘新亮[25]等通过以下3个步骤完成沙门氏菌的快速检测：首先采用全自动荧光酶免疫分析仪(mini VIDAS)来进行初筛，随后采用沙门氏菌显色培养基来复筛，最后采用全自动的微生物鉴定仪(VITEK 2 Compact)来进行阳性菌株的生化性状的鉴定。该联用法初筛时能在45 min之内准确鉴定出阳性菌株，阳性菌株经沙门氏菌显色培养基分离纯化后按照VITEK检测的结果与血清学凝集试验结果相结合即可以判断它是否属于沙门氏菌。采用该方法对395种食品和水产品中的目标菌同时检测的结果与国标法完全一致，其准确性好，并且还具有快捷高效、自动化程度高的特点。

4 结束语

传统国标法检测乳制品中的相关致病菌具有特异性差、操作繁琐、效率低等不足，很难实现快速有效的检测。免疫学方法存在灵敏度低、对抗体依赖、价格高昂等缺点，而分子生物学，由于特异性强灵敏度高，逐渐应用于致病菌的快速检测，但其也存在以下不足需要改进：1)需要购买昂贵的仪器设备；2)等温核酸扩增技术适用于现场做大量样品的快速检测，反应简单，但存在易产生假阳性和假阴性的缺点；3)新开发的PMAxx-RAA方法实现了在死菌存在的环境下检测出活的致病菌，避免了常规分子生物学方法的缺点。在今后的研究中对于等温核酸扩增技术存在假阳性、假阴性等问题，需要进一步加强对此技术反应体系和反应条件的不断优化，相信RAA技术能利用其优势，成为乳制品中致病菌检测的重要方法。