介绍一种简单易行的组织芯片制作方法

武振汝，陈梦琳，李 丽，石毓君，步 宏,2

组织芯片技术又称组织微阵列(tissue microarray, TMA)，是将数十至上百个小组织块按预先设计的阵列图排列在同一玻片上形成矩阵的微缩组织块。由Kononen等[1]首次提出，并证实了其实用价值。组织芯片具有体积小、易操作、信息量大等特点，该技术被广泛应用到临床和科学研究中。组织芯片有多种制作方法[2-4]，但鉴于设备昂贵，操作复杂，不易切片，掉片率高等问题未被推广使用。本科室在此基础上进行改进，总结出一种操作简便，成本低廉，切片简单，不易掉片，易于推广的组织芯片制作方法，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取四川大学华西医院生物样本库肝细胞癌、肝内胆管癌以及其对应的癌旁冷冻新鲜组织800例。

1.2 耗材与仪器石蜡(熔点58 ℃)、HE染液、显微防脱玻片、组织切片机(HM355S型)等，均购自美国Thermo Fisher公司；组织芯片仪(Quick-Ray，UNITMA，中国)；特尖头长嘴镊子(深圳上河科技公司)。

1.3 组织芯片制作步骤

1.3.1制备供体蜡块 冷冻新鲜组织用镊子从冻存管中取出，在组织未完全融化时用取材刀修整成大小2 cm×1.5 cm×0.3 cm的组织块，修整好的组织放入10%中性福尔马林中固定48 h后，按照常规方法脱水、浸蜡、包埋。包埋好的蜡块首先切片行HE染色，显微镜下观察HE染色结果，并圈出所需病变的位置，对应切片中圈出的位置，用记号笔在蜡块上轻轻标出穿刺点。

1.3.2制作工具准备和组织微阵列的设计 准备组织芯片制作使用的工具，骨髓穿刺针或机械组织芯片仪用于从供体蜡块上取组织柱，刀片用于修整组织柱，长尖镊用于夹取组织柱植入微阵列包埋模具(图1)。

图1 微阵列蜡块制作工具：A.骨髓穿刺针；B.组织芯片仪取样针；C.刀片；D.长尖嘴镊

在电脑上设计出边长为2 mm的正方格排列图，用A4纸打印，用剪刀剪裁出10×12的方格图，使剪裁出来的方格图刚好铺在包埋模具的底部。

1.3.3包埋模具准备 选取底面最大型号的包埋模具，包埋模具和剪裁好的10×12的方格图在65 ℃液态石蜡中预加热，加热完毕后用镊子把10×12的方格图放置在包埋模具内部，从蜡液中取出包埋模具并倾倒出其内部多余的蜡液，包埋模具室温冷却后待用(图2)。

1.3.4制作微阵列蜡块 制作微阵列蜡块前应先将供体蜡块在37 ℃烤箱中预热20 min或65 ℃烤箱中预热3 min，再将受体蜡块置于平整工作台，用机械穿刺针或骨髓穿刺针打孔。打孔前先将穿刺针针芯抽出，对准欲穿刺阵点垂直向下均匀用力使针套穿透供体蜡块，再将穿刺针套拔出，用穿刺针针芯把针帽套内组织柱轻轻推出置于洁净平板上，用切片刀片把穿刺好的组织柱两端修平，再用长嘴尖镊把修好的组织块按照预先设定的位置面朝下摆在包埋模具内，此为打好1个孔。穿刺供体蜡块前应制作10×12表格写入供体蜡块编号，穿刺时按此顺序进行。待包埋模具全部点阵(一般最后2或4个点不用穿刺以便定位)后(图3)，将摆有组织柱的微阵列包埋模具小心移动到65 ℃包埋台上。等待微阵列包埋模具底部原有石蜡融化，在此期间可以用镊子蘸取一滴蜡液从包埋模具边缘滴入包埋模具里面，待组织柱中的石蜡彻底融化，把微阵列包埋模具轻轻转移到平整的冷台上，这时微阵列包埋模具底部蜡液会很快变白凝固，同时组织柱也会被微阵列包埋模具底部的蜡液黏住，与此同时迅速用镊子引流将蜡液灌注到微阵列包埋模具中，灌注完毕后在模具顶部加盖包埋盒。为防止组织柱被蜡液冲倒，在灌注蜡液时需从微阵列模具的边缘灌注并且动作要轻柔，另外需要用镊子引流。防止芯片蜡块底部产生空洞，微阵列模具摆上冷台后要立马灌注，并且最好是选取微阵列模具的两个对角，沿着两个对角同时灌注，最上层盖上包埋盒，等蜡块冷却后从微阵列模具中取出包埋好的蜡块，微阵列蜡块制作完毕(图4)。

②③④

1.3.5切片 芯片蜡块最好用新刀片在切片机上切片，避免产生刀痕，为提高切片得片率，尽量根据蜡块平面调整切片角度，做到少修片和连续切片。裱片操作时，要轻，速度掌握适宜，否则容易造成组织阵列偏移。另外，还要注意控制水温在45～50 ℃。

1.3.6HE和免疫组化染色 制作完毕的组织芯片切片在65 ℃干燥箱中烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，行HE染色或EDTA微波热修复15 min，滴加PD-L1抗体(1 ∶100稀释)，室温孵育1 h，PBS充分洗3次，滴加免疫组化二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，数字病理扫片仪采图。

2 结果

2.1 芯片制作用该方法共制作肝癌和癌旁组织37个芯片蜡块，合计2 200个组织位点，圆形芯片组织以规则的点阵方式整齐排列，芯片完整，无点阵移位现象。芯片中的组织芯点为所需要的组织形态学区域。所有列阵蜡块均未见裂开，蜡块表层也没有产生空洞，组织位点排列整齐，位点无丢失。组织柱与周围载体蜡结合紧密形成完整蜡块，芯片蜡块上的组织芯点排列整齐在同一平面上。芯片蜡块易切片，通过多次验证每个蜡块均能切出至少300张完整的芯片切片。

2.2 芯片HE和免疫组化染色制备完毕抽取一套完整切片进行HE和免疫组化染色。HE染色结果显示：无刀痕和脱片现象，位点组织形态及细胞结构均清晰可辨(图5)。人胆管癌组织免疫组化PD-L1染色结果显示：均匀表达在细胞膜，特异性强(图6)。整个染色流程中切片无脱片，所有位点完好无损。以上结果证明，组织芯片制作技术成熟，已达到技术标准。

图5 肝癌组织芯片HE染色

图6 胆管癌组织芯片免疫组化PD-L1染色，EnVision法

3 讨论

文献报道的组织芯片制作方法很多，根据是否需要受体蜡块分为两类，需要受体蜡块制作的组织芯片[5-6]方法繁多，但步骤繁琐，受体蜡块的预制孔常与组织柱大小不一致，切片时会散片、掉片。另外组织柱植入受体蜡块后需要烤蜡块，对烤蜡块的温度和时间很难把控，温度过高或时间过久会造成蜡块坍塌，而温度过低或时间太短会造成切片困难。

无需受体蜡块的组织芯片制作时需要用胶水把组织柱黏附在包埋模具底部[7-9]，过夜晾干的过程操作复杂且有组织柱倾倒风险。

本课题组借鉴前人经验，制作的组织芯片有以下优势；(1)无需受体蜡块，操作简便；(2)包埋模具底部贴有微阵列图利于组织柱摆列整齐；(3)微阵列图利用蜡液黏附在包埋模具底部，组织柱亦通过蜡液的黏附性植入微阵列图上，无需胶水，节约时间并且不易产生空洞；(4)在灌注蜡液时组织柱同样受到蜡液的黏附不易倾倒；(5)包埋出的组织芯片易于切片，产片率高并且不易掉片。因此，该方法简单易行，成本低，易于推广。