Bcl-2 和LC3 对膀胱癌发生发展及预后的相关性分析

周万里 张建平▲ 潘永昇 徐卫东

1.南通大学附属海安医院泌尿外科，江苏南通 226600；2.江苏省南通市第一人民医院泌尿外科，江苏南通 226300

膀胱癌发病率在世界范围内居恶性肿瘤第九位，死亡率排名第十三位，为泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]，且其发病率呈上升趋势[2]，其中最常见的为膀胱尿路上皮癌[3-4]。非肌层浸润性尿路上皮癌患者多采用经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT），而晚期患者则需辅助全身放化疗[5-6]。研究膀胱癌的发病机制是国内外学者研究的重要课题[6]。细胞的凋亡与恶性增殖参与肿瘤的发生、发展[7]，其中Bcl-2 发挥抗凋亡作用，参与细胞癌变[8]。细胞自噬与细胞的癌变密切相关[9]。LC3 是自噬相关基因，参与自噬的调控[10-11]。本课题通过核酸干扰技术下调膀胱尿路上皮癌中Bcl-2 的表达，并研究细胞中LC3 表达及其对膀胱肿瘤细胞生物学行为的影响，分析其与临床病理的相关性，从而探讨Bcl-2 与LC3 的表达与膀胱癌临床病理和预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 试剂

真核细胞表达载体pGenesil-1 购自上海生工，大肠杆菌DH5α 和人膀胱癌细胞株T24 为本实验室保存，高糖DMEM 培养基（货号：12800082）购自Gibco公司；RNA 抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司（货号：SK1322）；MTT 购自Sigma（货号：M5655-1G）；DMSO 购自生工生物工程（上海）股份有限公司（货号：DN3039A）；Lipofectamine2000 购自Invitrogen（货号：11668-027）；LC3 和Bcl-2 兔抗人抗体购自Abcam（货号：ab192890、ab32124）；SP 免疫组化试剂盒（货号：SP0041）购自福州迈新公司。

1.2 体外实验

1.2.1 在膀胱尿路上皮癌细胞 （T24） 中转染siRNA在高糖DMEM 培养基中于37℃、5%二氧化碳条件下培养T24 细胞，以5×105个/孔的密度接种在6 孔板中，使用脂质体转染法，Lipofectamine2000 与重组质粒的比例为5∶1。对照组为空质粒和NC 质粒。

1.2.2 RT-PCR 检测Bcl-2 和LC3 mRNA 表达 收集细胞，Trizol 法提取RNA，分光光度计检测纯度，80 V恒压下电泳进行完整性检测。RNA 样品经逆转录反应合成cDNA 第1 链，然后进行PCR 扩增，β-actin 作为内参。扩增条件：50 μL 反应体系，cDNA 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP mix 4 μL，二价镁离子（50 mmol/L）1.5 μL，上游引物（20 μmol/L）1 μL，下游引物（20 μmol/L）1 μL，Taq 酶0.5 μL，加DEPC 水至50 μL。反应条件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，这部分重复30 个循环；72℃5 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，图像使用Quantity One 软件（Bio-Rad）进行定量分析。

1.2.3 Western blot 检测Bcl-2 和LC3 蛋白表达 收取细胞，PBS 洗涤2 次，加入裂解液，冰上孵育20 min，4℃条件，13 000 r/min 离心10 min，收集上清。使用BCA 试剂盒进行蛋白定量，取10μg 蛋白进行SDS-PAGE。使用湿转电转膜仪（BIO-RAD）100 V 恒压60 min 条件下将蛋白质转到NC 膜。使用含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭1 h，TBST 洗涤。Bcl-2 单抗（或LC3 单抗）4℃孵育过夜，TBST 洗涤。使用HRP 二抗室温孵育1 h，TBST 洗涤后加入ECL 试剂，使用GE 成像系统拍摄，使用Quantity One 软件进行定量分析。

1.2.4 细胞生长活力检测 将转染不同质粒的T24 细胞接种到96 孔板中，设置PBS 空白对照组。加入MTT溶液后培养4 h，弃去培养基，加入DMSO，室温振荡10 min，测定570 nm 处的吸光度，每组实验重复3 次。

1.2.5 细胞凋亡检测 采用Annexin-V 与PI 双染法流式细胞术检测转染后的T24 细胞细胞凋亡。胰蛋白酶消化细胞后，分别加入Annexin-V 和PI，进行流式细胞术定量检测。

1.3 在人体组织中研究Bcl-2 与LC3 的表达

1.3.1 组织样本 收集2017 年1 月—2020 年5 月在南通大学附属海安医院泌尿外科进行经尿道膀胱肿瘤电切手术及膀胱镜活检的部分标本65 例，其中正常膀胱组织10 例，膀胱尿路上皮癌55 例，所有研究对象术前均未接受任何辅助治疗。55 例膀胱癌标本中，男48 例，女7 例；年龄28～88 岁，中位年龄67 岁；按国际抗癌联盟（UICC）的2002 年TNM 分期标准：Ta期26 例，T1期9 例，T2期14 例，T3期2 例，T4期4 例；42 例不伴淋巴结转移，13 例伴淋巴结转移。入组患者均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.3.2 石蜡固定 切取4 mm×4 mm×4 mm 的标本，以10%甲醛进行固定，然后石蜡包埋，进行41 μm 厚度连续切片并将其裱于APES 打底玻片。

1.3.3 免疫组化染色 采用免疫组化（SP 法），将组织芯片进行常规脱蜡至水，以及微波抗原修复，然后滴加过氧化物酶阻断液，37℃下孵育10 min，加入非免疫动物血清，37℃下孵育l0 min，加入一抗工作液，37℃孵育1 h，加入生物素标记的二抗，37℃下孵育10 min，然后DAB 显色10 min，进行苏木精复染，脱水透明后，进行中性树胶封固。阴性对照中以PBS 代替一抗。

1.3.4 结果判断 Bcl-2 和LC3 蛋白的染色信号主要位于细胞质中。由两名病理医师阅片，随机选取每张切片的5 个视野（40×），各对100 个细胞进行镜检，然后进行阳性细胞百分率和细胞染色强度评估，阳性细胞百分率4 个等级。0 分：无阳性细胞；1 分：阳性细胞数＜20%；2 分：阳性细胞为20%～75%；3 分：阳性细胞数＞75%。染色度4 个等级：0 分为无染色，1 分为淡黄色，2 分为黄色，3 分为棕黄至棕褐色。总积分为二者分值的乘积：0 分（-），l～3 分（-/+），4～6 分（+），7～9 分（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验

2.1.1 Bcl-2 和LC3 mRNA 的表达情况 转染重组质粒pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 之后，Bcl-2 mRNA 表达量及LC3 mRNA 的表达发生了下调。见图1。

2.1.2 Bcl-2 和LC3 蛋白表达的变化 转染pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 重组质粒后，Bcl-2、LC3 蛋白表达下调。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 组Bcl-2 和LC3 蛋白表达低于NC 组及空质粒组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 Bcl-2 和LC3 蛋白表达的变化

2.1.3 T24 转染Bcl-2 siRNA 后细胞生物学行为的变化 pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 组细胞活力[（66.8±5.8）%]低于空质粒组[（94.2±2.1）%]及NC 组[（92.4±1.9）%]，差异有统计学意义（F=15.62，P=0.016）。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA 组细胞凋亡率（56.68%）高于空质粒组（5.88%）和NC 组（5.03%），差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 人体组织中Bcl-2 与LC3 的表达意义

2.2.1 免疫组化检测癌与癌旁组织中Bcl-2 与LC3的表达 Bcl-2 和LC3 蛋白的阳性表达（箭头所指）主要定位在细胞膜和细胞质，偶有胞核染色，为淡黄色或棕褐色。见图3。正常膀胱组织和膀胱癌中LC3 表达的阳性率分别为27.27%（3/11） 和69.09%（38/55），表达差异有统计学意义（χ2=6.81，P ＜0.05）。Bcl-2 蛋白在正常膀胱组织及膀胱尿路上皮癌中的表达的阳性率（18.18%、60.00%）比较，差异有统计学意义（χ2=6.43，P ＜0.05）。

图3 Bcl-2 和LC3 在膀胱尿路上皮癌中的阳性表达（40×）

2.2.2 癌组织中Bcl-2 与LC3 的表达与临床预后及病理参数的关系 不同分级、分期的膀胱尿路上皮癌样本中LC3 蛋白的表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。有无淋巴结转移的膀胱尿路上皮癌样本中Bcl-2 蛋白的表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

3 讨论

细胞自噬是一个经过严格控制的降解细胞内生物大分子和内源性底物的生理过程[12-14]。自噬有助于肿瘤细胞在恶劣条件下的生存，而自噬的过度又会引起自噬性死亡[15]，从而抑制肿瘤的发生和发展[16-17]，自噬与肿瘤的关系可能是双重的[18]。研究显示，抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL 与自噬蛋白前体结合[19]，LC3 是自噬的标志，在囊泡成核过程中有助于自噬囊泡的形成[20-22]。

表1 膀胱癌组织中LC3 与Bcl-2 的表达与临床预后及病理参数的相关性（例）

Bcl-2 基因是细胞凋亡的重要抑制基因[23-25]。本研究结果也证实Bcl-2 蛋白在膀胱尿路上皮癌中抗凋亡作用。Bcl-2 能预测膀胱癌的淋巴结转移情况。LC3 蛋白在膀胱尿路上皮癌组织中表达升高，提示膀胱癌中自噬活性升高[26]，且LC3 的表达水平随着膀胱尿路上皮癌分级和分期的提高而提高。因此Bcl-2 和LC3 的表达在调控膀胱癌起协调作用，这一作用机制可能为Bcl-2 作用于自噬蛋白前体结合调控LC3 的表达。因此两者结合能判断膀胱癌的预后。

本研究对Bcl-2 作用于LC3 的具体作用机制没有深入了解，且BCL-2 和LC3 在组织样本验证的例数偏少，期待以后大样本及长时间随访来综合判断膀胱癌患者生存及预后的情况。