哈尔滨市老年人膝关节骨性关节炎血清金属元素分析及生物标志物筛选*

王声雨，崔 宇，林 源

1.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150000；2.哈尔滨医科大学卫生管理学院，黑龙江 哈尔滨 150086

骨性关节炎（Osteoarthritis, OA）是以滑膜关节软骨退变为特征，伴随关节周围骨质增生，常累及关节滑膜、关节囊、软骨下骨、韧带等结构，是一种全关节疾病［1］。随着人口老龄化的逐年加剧，目前我国60 岁以上人口已超过1亿，骨性关节炎患者已经超过5000万。据不完全统计，我国60 岁以上和70 岁以上的老年人口中，骨性关节炎的发病率分别为55%和80%［2］。骨性关节炎对人们健康的危害早已引起了重视。对于晚期髋、膝、踝关节骨性关节炎的保守治疗效果较差，只有行关节置换或关节融合手术，而对于其他关节并没有有效的治疗方法，带来了严重的社会负担。虽然世界范围内广大学者经过多年的研究，但其发病机制仍未完全阐明。目前国内外对骨性关节炎发病机制的研究只要集中在细胞因子学说、基质金属蛋白酶降解学说、自由基学说、骨内压增高学说等。本研究采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析技术, 对重度膝骨性关节炎患者和对照组患者血清中21种元素进行分析, 探讨人体内金属元素的水平和疾病发生、发展的关系，为膝关节骨性关节炎的机制研究和诊治提供相关的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在研究对象选择的过程中，排除选择性偏倚，确定所有病例组及对照组研究对象均为哈尔滨医科大学附属第二医院骨关节外科住院患者，按病例组与对照组数量接近1∶1选择。

1.1.1 病例组及对照组的选择：病例组纳入标准:（1）黑龙江省哈尔滨市原籍居民；（2）在黑龙江省哈尔滨市居住≥20年的外来居民；（3）年龄介于50 岁～75 岁之间；（4）符合膝关节骨性关节炎诊断标准；（5）排除继发性骨性关节炎患者；（6）排除患有糖尿病等代谢性疾病、心脏病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤性疾病；（7）排除其他部位有临床表现的退行性疾病。对照组纳入标准：（1）黑龙江省哈尔滨市原籍居民；（2）在黑龙江省哈尔滨市居住≥20年的外来居民；（3）年龄介于50 岁～75 岁之间；（4）非关节疾病患者；（5）排除患有糖尿病等代谢性疾病、心脏病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤性疾病；（6）排除其他部位有临床表现的退行性疾病。

1.1.2 实验设备与试剂：电感耦合等离子体质谱仪Agilent 7700x（美国安捷伦科技有限公司）；-80°C 超低温冰箱U410（美国新布朗什维克科学公司）；涡旋混合器XK96-A（姜堰市医疗器械厂）；自动进样器Agilent IA-89（美国安捷伦科技有限公司）；纯化水制备系统MILLI-Q（美国密理博公司）多元素混合标准溶液（美国安捷伦科技有限公司）；多元素内标混合液（美国安捷伦科技有限公司）；调谐液（美国安捷伦科技有限公司）；硝酸（优级纯）；双氧水（优级纯）。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集及处理：应用无菌真空负压采血管采集研究对象的晨空腹静脉血，3 000 r/min 离心，取上层黄色半透明状液体即血清样本，分装，-80℃保存，备用。

1.2.2 样品测定:室温下解冻血清样本，涡旋振荡器中振荡混匀30 s，移取0.2血清样本至消解管后分别加入0.3 ml硝酸、0.3 ml 双氧水，置于130℃烘箱中消化2 h 至溶液澄清透明，取出冷却后定容，待测。取待测液样品置入电感耦合等离子体质谱仪自动进样瓶中，自动检测21种元素。电感耦合等离子体质谱仪最佳工作条件，见表1。

表1 电感耦合等离子体质谱仪最佳操作条件

1.3 统计学方法

本实验使用到的统计学软件包括：Epidata3.1、SIMCA-P12.0、SPSS 13.0，数据以均数±标准差（±s）形式表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。膝关节骨性关节炎患者组和对照组间元素含量的分析采用Mann-Whitney U检验以及偏最小二乘法。

2 结果

2.1 检出限、曲线相关系数、线性范围

本研究在避开同质异位素和氧化物等多原子离子干扰的前提下，选择各元素最高丰度的同位素进行测定，相关系数及检出限见，见表2。

表2 血清样品中21种元素检出限和相关系数

2.2 加标回收率和精密度实验

加标回收率测定是实验室确定方法准确性的质量控制手段之一，结果见表3。

表3 血清样本加标回收率及精密度

2.3 血清样本检测结果分析

实验对膝关节骨性关节炎患者组和健康对照组人群血清中铝（Al）、砷（As）、钡（Ba）、钙（Ca）、镉（Cd）、钴（Co）、铬（Cr）、铜（Cu）、铁（Fe）、锂（Li）、镁（Mg）、锰（Mn）、钼（Mo）、镍（Ni）、铅（Pb）、硒(Se)、锶（Sr）、钛（Ti）、铊（Tl）、钒（V）、锌（Zn）等21种元素进行测定，结果，见表4。

由于低于方法的定量检出限，实验中有6种元素（Ti、V、Ni、As、Mo、Tl）未能检出。所以本实验检测出了血清样品中15种元素，经过统计学分析，结果显示膝关节骨性关节炎组与对照组比较中， Li、Cr、Mn、Co、Cu、Se 的含量有显著差异（P＜0.05），其中Cr、Mn、Se 含量明显下降；而Li、Co、Cu含量明显升高。

表4 21种元素含量测定结果（±s） (μg/L)

注：带#元素为mg/L

元素Al Ba Ca#Cd Cr Co Cu#Fe#Li Mg#Mn Se Sr Pb Zn Control（n=71）32.05±19.22 33.25±13.50 106.75±23.12 1.00±0.25 48.00±23.50 0.50±0.25 1.12±0.30 1.81±0.68 4.75±2.25 24.11±3.91 10.00±5.25 90.50±29.00 70.25±27.00 21.00±9.50 710.25±313.75 OA（n=76）30.15±14.68 34.50±12.00 109.22±19.99 1.00±0.50 27.00±11.75 0.75±0.25 1.22±0.26 1.71±0.51 7.25±2.75 24.96±3.11 8.25±2.75 82.75±25.00 66.25±17.25 21.50±8.75 787.25±369.00 P 0.37 0.44 0.36 0.86＜0.001＜0.001＜0.001 0.19＜0.001 0.05＜0.001 0.02 0.15 0.62 0.07

2.4 多变量统计分析

主成分分析得分图能够直观的观察到各组样本分布情况，可以有效排除测定结果中的特异值见图1。本实验的结果显示，骨性关节炎组与对照组间相互交叠，并不能很好的对样品进行区分。

偏最小二乘判别分析为用于判别分析的多变量统计分析方法。通过得分图（图2），膝关节骨性关节炎组与对照组完全分开。并且可见此模型的具有较好的区分度和预测度。

图1 骨性关节炎病例组和对照组患者血清金属元素谱的主成分分析得分散点图

图2 骨性关节炎病例组和对照组血清金属元素谱区分的偏最小二乘法判别分析模型图

图3 PLS-DA模型的载荷图

2.5 金属元素生物标志物鉴定

研究中通过多变量统计分析中变量载荷的方法是探寻合适生物标记物的常用手段。表现形式主要有载荷图（Loading plot）和变量重要性投影（VIP），每种元素在模型中的贡献情况可以很直观的在图中体现。图3 中的每一个圆点代表一种元素，离原点越近说明这种元素对区分两组的贡献越小，反之越是远离原点，越提示此种元素可以有效区分两个实验组，而作为相应的生物标志物。

变量投影重要性分析（Variable Importance in Projection, VIP）是较多采取的用来评价变量贡献的方法。表5 为运用VIP 值来筛选的本研究中的差异元素，我们可以发现与前面用载荷图分析筛选的元素是一致的。所以综上所述，Cr、Co、Li、Mn四种元素可以认为是膝关节骨性关节炎病例组与对照组间明显的具有统计学意义的差异元素。

表5 病例组和对照组的差异元素

2.6 金属标志物的ROC分析

接收者操作特性曲线（receiver operating characteristic curve, ROC），简称ROC 曲线，可以直观反映待测指标诊断价值，AUC 的值介于0 到1 之间。AUC 越大，预测的诊断价值越大。结果见（图4），Li、Cr、Mn、Co 的曲线下面积分别为0.786，0.922，0.717 和0.858，均大于0.7，所以我们认为这些元素可作为膝关节骨性关节炎的敏感可靠的血清生物标志物。

图4 OA病例组与对照组金属元素的ROC分析

3 讨论

在本世纪初，Haraguchi提出了一个新的研究方向，系统的研究机体内的细胞、器官或组织中金属或类金属元素即“金属组学”［3-4］。它是对机体细胞和组织内，那些关系到金属元素的相关生理、病理过程进行研究的学科［5］。近年有研究表明在骨性关节炎的发生、发展中一些金属元素亦有一定作用［6-7］。但研究大多集中在少数几个元素上，例如铜，硒，锌和铁等元素。

本研究结果显示，膝关节骨性关节炎患者体内的含量与对照组相比，金属锂含量更高，差异有统计学意义。锂元素对骨细胞及软骨细胞代谢的影响具有双向性。有体外试验研究表明锂元素可以促使成软骨细胞进行分化，在机体内可以促进软骨的再生［8］。我们的实验结果显示骨性关节炎患者血清中锂元素的浓度高于对照组，这与Krachler的研究相一致［9］。近期有研究表明［10］在试验中给小鼠口服适当剂量的锂盐会引起小鼠的成骨反应、提高骨密度；我们都知道骨性关节炎的局部病理变化之一，是病变关节周缘的骨质增生及软骨下骨的骨硬化，所以推测人体血液中锂元素含量的升高可能与骨性关节炎某些特征性变化有关。有研究表明，氯化锂抑制了IL-1处理的人和小鼠软骨组织培养中蛋白多糖的降解；可以减轻软骨退化的严重程度。锂元素对骨及软骨的代谢是有确切影响的，但在何种环境下、会引起何种影响还有待我们进一步研究。

本研究中膝关节骨性关节炎患者血清中硒的含量明显低于对照组，推测人体内硒元素的缺乏可能是骨性关节炎发病诱因之一。硒元素是人体必需的一种微量元素，属于类金属元素，对维持人体身体健康起着至关重要的作用。硒与骨关节疾病的相关性有很多研究。有报道，通过膳食补充硒可以有效预防以关节破坏为主要症状的大骨节病［11］，研究者认为有机物腐蚀和粮食霉菌可以对人类的软骨产生腐蚀作用，但硒元素加速软骨细胞再生，促进修复软骨［12］。大骨节病与骨性关节炎在关节透明软骨的病理学改变上有相似之处，最终都是引起关节软骨的损毁；大量的研究已经证实硒缺乏是导致大骨节病发生的重要诱因，因此推测硒缺乏可能也与骨性关节炎的发生、发展密切相关［12，13］。

锰元素也是人体必需微量营养元素，它在人体中以活化剂的身份参与到多种酶系统的工作中。它在催化造血、参与机体蛋白质及维生素的合成及维持软骨结构功能中起到重要作用。已有相关研究显示人体血液系统疾病、神经系统疾病、肿瘤等的发生与体内锰元素含量异常有关［13，14］。本研究中膝关节骨性关节炎患者血清中锰元素的含量较对照组明显减低，说明锰元素在血清中的变化与骨性关节炎的发生是有相关性的。Ruiz Romero 等［14］对人体退变的软骨进行一系列的实验研究，包括聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）和免疫组织荧光技术等，发现作为线粒体的抗氧化蛋白，锰超氧化物歧化酶在骨性关节炎的表层软骨中明显减少，所以推测软骨细胞中线粒体的抗氧化蛋白锰-超氧化物歧化酶的缺乏导致软骨的抗氧化能力下降，导致软骨损伤及骨性关节炎的发生。但目前还未发现有相关研究表明单独补充锰元素对骨性关节炎有治疗作用［15］。

铬元素作为必需的微量元素，在人体金属代谢中发挥了重要的作用，是人体能量代谢过程中必不可少的的微量金属元素之一；铬元素除了参与糖类、脂质、胆固醇等代谢，还具有防止血管硬化的功能［13］。铬元素在骨组织的新陈代谢过程中发挥着重要作用，其中以离子状态的铬会影响成骨细胞的增殖，并对成骨细胞大小和形状产生影响［16］。除此之外，有研究表明铬元素也可以通过降低机体碱性磷酸酶的水平和增加钙的含量来影响成骨细胞的活性［17］。有国外研究表明，如果机体内金属铬的慢性聚集超过生理需求量的1.5倍，便可以引起骨量大量丢失，导致成骨细胞和软骨细胞的损伤，从而影响骨代谢过程。造成动物骨关节疾病的发生［18］。Scimeca M 等人在对25例骨质疏松症和25 例骨性关节炎患者的骨进行研究时发现，在这些患者体内铅，镉和铬的含量要明显高于正常人［19］。

钴元素是人体必需的微量元素。有研究表明，钴可通过调节骨细胞代谢，从而影响骨吸收和骨形成的过程［17］。此外，Fleury 等人证明通过钴在体内的累积，骨组织中的氧化应激水平会得到进一步增加。这些效应可能是通过成骨样细胞中的氧化还原状态介导的，但其作用机制尚不清楚［20］。铜元素在人体的新陈代谢中发挥着重要的作用，在机体的大多数免疫细胞正常工作的过程中起着重要的作用，对维持机体防御系统的稳定帮助很大。有研究者认为铜可以降低骨转换的速率，这是由于它可以对人体的成骨细胞和破骨细胞产生抑制作用来实现的。与此同时，作为赖氨酰氧化酶（LOX）的重要辅助因子，铜在胶原蛋白交联弹性蛋白时起到至关重要的作用。机体内铜的含量长时间处于低水平状态将使这些功能处于抑制状态，严重的话将会引起软骨的病变和破坏。但一项动物实验研究显示：在比较吲哚美辛相关制剂对骨性关节炎的影响中发现，添加铜元素的吲哚美辛制剂组的大鼠，在骨性关节炎症缓解程度上较对照组有一定优势，并且无论是在制剂的安全性方面还是在治疗效果方面，铜-吲哚美辛合成剂即使是应用最低的剂量也有非常好的表现［21］。

本研究希望通过金属组学研究平台发现哈尔滨市膝关节骨性关节炎患者血清中金属元素变化情况及规律，筛选敏感、可靠的生物标志物，为膝关节骨性关节炎的早期预防，早期诊断和早期治疗提供科学的依据。