不同采摘月份木姜子果挥发性成分测定*

周丽免，李 佳，樊爱萍 ，白忠彬

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.红河学院 理学院，云南 蒙自 661100)

木姜子(Litsea euosmaW.W.Smith)，又名山苍子，为樟目(Laurales)樟科(Lauraceae)木姜子属(LitseaLam.)的常绿或落叶乔木或灌木植物[1]，主要分布于亚洲的热带和亚热带，中国主产于南方及西南温暖地区[2]。木姜子多生于海拔300～3 200 m 的向阳坡地、灌木丛、稀疏林、林中路旁和水边[3]。目前，中国部分省份已人工营造木姜子林，其中以福建、湖南和四川等省营造面积最大[4]。木姜子中的化学成分主要有生物碱、脂肪酸和木质素等，它们存在于植株的根、茎、叶、果实、花及种子等器官和组织中，且不同部位其化学成分的组成和含量差异较大[5]。在传统中药学上，木姜子的根、茎、叶、树皮和果实皆可入药，具有清热解毒等功效，并可预防和治疗类风湿性关节炎[6]。SEAL 等[7]研究表明：木姜子挥发油可以诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，进而对人类非小细胞肺癌有一定的疗效。

木姜子挥发油有特殊的清香气[8]，民间有作为食品香料应用的先例，但木姜子油提取商业化程度低，不同月份木姜子油的挥发性成分富集规律变化未见研究报道。目前对木姜子的研究主要是对其叶、花和果实挥发油化学成分的分析[5]，然而由于木姜子的化学成分和生物活性可能随果实生长过程而变化，因此采摘时间会影响其精油的产量和质量[9-11]。因此，本研究通过油浸提(热浸提和冷浸提)、超声波辅助浸提和水蒸气蒸馏3 种方法提取木姜子精油，并确定最佳提取方法；采用最佳提取方法提取5、6 和7 月的木姜子果精油，运用气相色谱−质谱联用仪对其化学成分进行分析，比较5、6 和7 月木姜子果挥发性成分的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜清香木姜子果采自云南省红河州蒙自市期路白乡。5 月木姜子果(简称“5 月果”)处于幼果时期，果实近球形，直径约1～1.5 mm，绿色，果梗长约3 mm，先端不增粗；6 月木姜子果(简称“6 月果”)处于幼果与成熟果的过渡阶段，果实近卵球形，绿色，有白色小点，直径约2～3 mm，果梗长约4 mm，先端不增粗；7 月木姜子果(简称“7 月果”) 为晚年成熟期，果扁球形，直径约5～6 mm，蓝黑色，果梗长约5～6 mm，上部稍肥大，有稀疏短柔毛。

1.2 试验方法

1.2.1 木姜子精油的制备

(1) 植物油热浸提

选择颜色正常、大小均匀、无杂质霉变(即新鲜的、成熟度一致)的木姜子鲜果，采用分析天平准确称取20.0 g 置于装有50.0 mL 玉米胚芽油的250 mL 圆底烧瓶进行浸提，采用温度计进行控温，油温控制在80～90 ℃，提取时间20 min。待温度降至室温，采用6 层纱布过滤提取液，在滤液中加入5.0 g 无水硫酸钠(Na2SO4)除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存备用。

(2) 植物油常温冷浸提

采用分析天平准确称取新鲜且成熟度一致的木姜子鲜果20.0 g，置于装有50.0 mL 玉米胚芽油的烧杯中，常温浸提20 min。采用6 层纱布过滤提取液，在滤液中加入5.0 g 无水硫酸钠(Na2SO4)除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存备用。

(3) 超声波辅助溶剂萃取法(UAE)

选择新鲜且成熟度一致的木姜子鲜果，按木姜子鲜果∶玉米胚芽油=20.0 g∶50.0 mL 的料液比置于带盖的不锈钢杯中，用超声波仪器在超声频率100 kHz、振幅0.6 A、水浴温度35～50 ℃条件下进行水浴浸提，提取时间60 min。采用6 层纱布过滤提取液，在滤液中加入5.0 g 无水硫酸钠(Na2SO4) 除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存备用[12]。

(4) 水蒸气蒸馏法

挑选颜色正常、大小均匀、无杂质和霉变且成熟度一致的新鲜木姜子果40.0 g，按照料液比1∶4 (g∶mL)加入蒸馏水160 mL，置于250.0 mL圆底烧瓶中；将圆底烧瓶接入蒸馏装置进行加热，待木姜子和蒸馏水混合液沸腾后，将电炉调节至微沸，使冷凝液滴下的速度约为1 滴/s，回流提取3 h；蒸馏完毕后，关闭电炉，待装置冷却后，收集浅黄色透明提取液，其气味芬芳浓郁。将提取液与50 mL 玉米胚芽油混合，并加入5.0 g 无水硫酸钠 (Na2SO4)除水，于4 ℃冰箱保存备用[13]。

1.2.2 GC-MS 分析条件

通过GC-MS 检测条件优化，具体操作如下：

(1) 色谱条件：色谱柱Rtx-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 µm)，载气为高纯度He，流速5 mL/min，分流比20∶1，进样量1 µL，进样口温度保持250 ℃。升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min速率升至220 ℃，保持2 min。溶剂延迟时间3 min。

(2) 质谱条件：EI 离子源温度250 ℃；电离电压88 eV；质量吹扫范围：35～500 m/z。

(3) 静态顶空条件：进样针体积2.5 mL；进样体积500 µL；振荡箱温度100 ℃；振荡时间20 min；进样针温度80.0 ℃；补偿时间1 s；进样速度500 µL/s；气体吹扫时间120 s。

1.2.3 木姜子精油含量的测定

比较1.2.1 节中4 种木姜子精油制备的效果，测定选择最佳制备方法的木姜子出油率。

出油率=精油质量/木姜子鲜果质量×100%。

1.2.4 化学成分定性及定量分析

将3 个采摘期的木姜子精油样品及未经处理玉米胚芽油分别用移液枪吸取1 mL 样品装入20 mL 顶空进样瓶，进样量为1 µL，于GC-MS进行测定。通过HP MSD 化学工作站等手段检索WILFYT/SWTLIBRARY/PESTICD/NIST 147/NIST 05 标准质谱的图库，同时结合质谱相关数据库资料[14-16]，通过双重标准(化合物出峰保留时间和化合物的质谱图)定性，确定木姜子精油挥发性物质的可鉴别化学成分，采用峰面积归一化法定量分析。

1.3 统计学分析

采用Excel 2016 分别对5、6 和7 月果实挥发性成分含量、保留时间和离子峰强度进行数据统计，Origin 8.5 作图，Adobe Illustrator CS6 进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 木姜子精油制备方法的比较

由图1 可知：水蒸气蒸馏法提取的精油经GC-MS 检测出峰最多，挥发性成分丰度较佳，水蒸气蒸馏法提取木姜子精油效果最佳，故本研究采用水蒸气蒸馏法提取5、6 和7 月果木姜子精油。

2.2 精油含量

清香木姜子5、6 和7 月果的精油提取率分别为0.50%、3.03% 和5.53%，说明精油含量随着果实成熟度的生长而增加，风味也越发浓郁饱满。

2.3 木姜子精油挥发性成分的GC-MS 分析

由图2、表1 可知：经气质检测，采用顶空固相微萃取从木姜子5 月果精油样品中共注册100 个峰，即检测到100 种成分，共鉴定出32 种化合物，占检出总量的78.36%。其中，萜烯类化合物17 种，占总量的45.97%；醇类化合物4 种，占总量的26.14%；酮类化合物1 种，占总量的0.85%；醛类7 种，占总量的4.38%；烷烃类2 种，占总量的0.29%；胺类1 种，占总量的0.72%。含量超过1% 的有10 种，占总含量的74.39%；含量最高的组分为双戊烯(26.87%)，其次为芳樟醇(18.87%)。

图1 不同加工方法提取木姜子精油总离子流Fig.1 Total ion chromatograms of essential oil extracted from L.euosma by different processing methods

图2 不同采摘月份木姜子精油总离子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatogram of L.euosma essential oil in different picking months

由图2、表2 可知：经气质检测，采用顶空固相微萃取从木姜子6 月果精油样品中共注册100 个峰，即检测到100 种成分，共鉴定出49 种化合物，占检出总量的87.49%。其中，萜烯类化合物14 种，占总量的33.29%；醇类化合物7种，占总量的5.49%；酮类化合物2 种，占总量的3.31%；醛类16 种，占总量的34.39%；烷烃类4种，占总量的1.76%；胺类1 种，占总量的5.45%；新增加酸类4 种，占总量的2.8%；酯类1 种，占总量的1%。其中含量超过1%的有22 种，占总含量的95.08%；含量最高的组分为双戊烯和柠檬烯，均为14.61%。

由图2、表3 可知：经气质检测，采用顶空固相微萃取从木姜子7 月果精油样品中共注册100 个峰，即检测到100 种成分，共鉴定出98 种化合物，占总检出量的98.04%。其中，萜烯类化合物19 种，占总量的14.54%；醇类化合物26 种，占总量的15.39%；酮类化合物13 种，占总量的5.95%；醛类19 种，占总量的53.74%；烷烃类4 种，占总量的2.84%；酸类5 种，占总量的1.98%；酯类6 种，占总量的2.54%。7 月果中新增加呋喃类3 种，占总量的1.54%；铵类1 种，占总量的1.29%；酚类1 种，占总量的0.16%，在7 月果中未检出胺类成分。其中含量超过1%的有25 种，占总含量的85%；含量最高的组分为柠檬醛(15.89%)。

表1 木姜子5 月果精油样品化学成分Tab.1 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in May

2.4 不同采摘月份木姜子果的同种化学成分分析

由表4 可知：随着果实的成熟，木姜子5、6、7 月果中的萜烯类(如β-蒎烯和双戊烯等)和醇类(如桉叶油醇和芳樟醇)物质含量总体呈减少趋势；醛类(如柠檬醛)和酮类(如甲基庚烯酮)物质含量总体呈增加趋势。感官上挥发性成分风味也越来越浓郁，留香时间更长，表明同种挥发性成分变化与果实成熟度正向相关。

3 讨论

从化学成分来看，木姜子5 月果中鉴定出32种化合物，占检出总量的78.36%。挥发油组成主要包括萜烯类、醛类、醇类和酮类。其中主要成分为萜烯类(45.97%)和醇类(26.14%)。5 月果挥发油成分萜烯类物质含量较高。萜烯类具有很强生物活性，被认为是解毒和溢出代谢的产物，被证实是对其他生物的驱避剂或引诱剂，使得人们相信萜烯在有机体之间的拮抗或互惠作用中起着重要作用[17]。用它制成的药可以驱虫，且对植物的生长具有重要作用。因此，若想要以木姜子萜烯类及醇类精油挥发性成分作为功效治疗时建议采用5 月果实。6 月果精油中共鉴定出49 种化合物，占检出总量的87.49%。挥发油组成主要有：萜烯类、醛类、醇类、酮类、酸类和酯类。其中主要成分为萜烯类(33.29%) 和醛类(34.39%)。6 月采摘的木姜子在果实感官品质上优于5 月果。6 月果中，萜烯类物质种类增加，但含量低于5 月果，致使其中萜类气味及药味等不良气味减少，其中醛类物质种类及含量丰富。萜烯类及醛类物质具有很好的抗氧化作用，也是很好的香辛料成分[18-19]。因此，若想以醛类和萜烯类精油挥发性成分作为研究对象时，建议采用6 月采摘的木姜子果。7 月果精油中共鉴定出98 种化合物，占检出总量的98.04%。挥发油组成主要有：萜烯类、醛类、醇类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、乙酐和乙酸铵等组分，主要成分有醛类(53.84%)和醇类(15.39%)。7 月果的萜烯类含量远远低于5 月果，出现新的化合物，从化学族种类及含量上更加饱满；挥发性成分更加复杂多样，感官上风味更加浓郁，香味越发饱满，香味浓烈且留香较长。木姜子7 月果挥发性成分中醛类化学族占比量较大，其中柠檬醛含量丰富(15.89%)，其具有柠檬的香气，是重要的香料，也是合成紫罗兰酮的主要原料，同时具有平喘和抗菌功效[20-21]。另外，挥发油中的香叶醇、橙花醇，具有玫瑰的香气，也是重要的香料。因此，若想要更好地研究醛类物质的功效或者应用于食品添加剂和香料开发，建议采摘7 月的木姜子果实。

表2 木姜子6 月果精油样品的化学成分Tab.2 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in June

从化合物类型来看，在木姜子果实的挥发油中，单萜类化合物为最主要的成分。单萜类化合物是存在于植物界的一类化合物，其生物活性是多方面的，并且是某些中药的主要有效成分。如在木姜子果实的精油中的主要单萜类化合物有柠檬醛、甲基庚烯酮、桧烯、柠檬烯、芳樟醇、月桂烯、香茅醛和蒎烯等活性有效成分，分别具有驱虫、镇痉、平喘、镇咳、祛痰、抗菌和抗病毒等作用[22]。此外，其果实的精油还含有倍半萜化合物类型的组分，且精油中某些萜类合成的酶基因部分功能已被证实[23]。萜类化合物具有广谱的药理活性和较低毒性，已成为国内外天然药物开发利用研究的热点[24-25]，据文献报道萜类化合物还具有抗艾滋病毒和抗肿瘤等较强生物活性[26]。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎和抗菌等作用[27]。生物活性的变化取决于精油的组成，因此，精油的生物活性可能取决于它的采收时节及生存环境。由于试验周期的缘故，本研究的重点在于3 个采摘月份木姜子果化学成分的提取及分析，与大萼木姜子[28]及木姜子[29]挥发油的化学成分比较，该研究结果中清香木姜子挥发油组成有很大区别，这说明木姜子在药用选材中必须考虑其种类及产地，才可以充分保证其药用功效的发挥。清香木姜子挥发油是否和木姜子属其他植物一样具有抗菌作用，以及其效果如何还有待于进一步研究。

表3 木姜子7 月果精油样品化学成分Tab.3 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in July

表4 不同采摘月份木姜子精油同种挥发性成分变化Tab.4 Changes of volatile components of the same kinds of essential oil from L.euosma in different picking months

4 结论

(1) 水蒸气蒸馏法更适宜本研究提取木姜子精油，适宜工艺条件为：料液比1∶4，提取时间3 h，5、6 和7 月果的精油提取率分别为0.50%、3.03%和5.53%。

(2) 应用顶空进样固相微萃取技术提取清香木姜子新鲜果实挥发性组分，经GC-MS 技术检测，5、6、7 月果的化学成分分别为32、49 和98 种，分别占挥发性组分总量的77.29%、87.49%和98.04%。5 月果的主要化学成分是萜烯类化合物；6 月果中萜烯类化合物含量不及5 月果，但种类增多，且新出现了油酸、正十五酸和丙氨酸乙酯等化合物；7 月果的萜烯类化合物含量减少，醛类物质种类和含量增加，出现香芹酚、乙酐、乙酸铵和呋喃类等新化合物。