捻转血矛线虫耐药相关基因P450 原核表达及其生物信息学分析

王文龙，苏 倩，赵学亮，孙 柯，翟 帅，王腾宇，呼和巴特尔

（内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属于毛圆科血矛属，其主要以吸食宿主血液为生，会导致宿主出现贫血、消瘦、皱胃粘膜损伤等症状[1]，严重者可致宿主，特别是幼龄宿主死亡。目前捻转血矛线虫病呈全世界性分布，尤其是热带、亚热带及降雨量充沛的地区[2]。而关于该病的治疗，临床上常使用伊维菌素、阿苯达唑、左旋咪唑等[3]药物。其中阿苯达唑作为一种广谱、高效、低毒的抗蠕虫药物，在国内外普遍使用[4]。但阿苯达唑的不合理使用导致捻转血矛线虫对其产生了耐药性[5]，给养殖业带来重大的经济损失。研究发现，对阿苯达唑产生耐药性的主要原因是捻转血矛线虫的I 型β 微管蛋白基因的3 个单核苷酸多态性（SNP）位点发生了突变（F167Y、E198A 和F200Y）[6-7]。

本实验室前期在耐药虫株给药前和给药后以及敏感和耐药虫株全转录组测序数据的基础上，筛选出捻转血矛线虫对阿苯达唑耐药的候选基因—细胞色素P450 基因（Cytochrome P450，CYP450）[8]。细胞色素P450 是存在于所有需氧生物的一种蛋白酶系[9]，参与药物代谢、自然发生分子的生物转化和外源性生物的氧化代谢等，被认为是与捻转血矛线虫耐药性相关的重要基因[10]。P450 通过增加酶的表达量、酶活力的改变加快机体对药物的代谢，使机体产生一定的适应性，从而产生耐药性。本实验构建了pET-P450 重组表达质粒，纯化得到P450 重组蛋白（rP450），并对该蛋白的生物信息学进行分析，为捻转血矛线虫耐药性的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料捻转血矛线虫采自内蒙古鄂尔多斯市乌审旗和乌兰察布市察右后旗，镜下鉴定雌雄后冻存。Trans1-T1 和E. coil BL21（DE3）感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD19-T、TRIzol 试剂、反转录试剂盒、DNA ATailing Kit、限制性内切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA连接酶、DNA Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司；表达载体pET-30a（+）由本实验室保存；质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自AXYGEN 公司；Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；溶菌酶、DNase I、苯甲基磺酰氟（PFMS）、MgCl2和SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝生物技术公司。

1.2P450基因的PCR 扩增和原核表达载体的构建与鉴定根据捻转血矛线虫全转录组测序数据通过Primer 5.0 软件设计扩增P450 基因的引物F：5'-GCAGAATTCATGGCTAACAGTGGACAGT-3'（EcoR I）/R：5'-CACTCGAGCTATGCAATCAAACTGG-3'（Xho I），引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。采用TRIzol法提取捻转血矛线虫的RNA 后，反转录为cDNA，以其为模板，利用上述引物经PCR扩增P450基因，胶回收PCR产物，测序鉴定后，克隆至pET-30a（+），构建重组表达质粒pET-P450 后经PCR、双酶切鉴定后，由北京六合华大基因科技有限公司测序鉴定。

1.3 rP450 表达的鉴定与纯化将pET-P450 转化E. coil BL21（DE3）感受态细胞构建pETP450/BL21，经IPTG 诱导蛋白质表达后，离心收菌，加入溶菌酶、DNase I、PFMS 和MgCl2裂解细胞，-20 ℃反复冻融，12 000 r/min离心15 min，收集上清和沉淀。将沉淀用终浓度8 mol/L 尿素充分溶解，离心收集上清用0.45 μm 孔径的滤器过滤后，按照Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒说明书纯化蛋白，利用SDS-PAGE 凝胶电泳检测rP450 的表达与纯化效果。

1.4 P450 蛋白的生物信息学分析利用ExPASy-Prot Param 分析P450 基因编码产物的组成及理化性质[11]；利用TMHMM Server 预测P450 蛋白的跨膜区结构[12]；利用SignaIP 4.1 Server 分析P450 蛋白的信号肽[13]；利用Bepipred 1.0 Server、ABCpred Predic⁃tion Server[14]以及DNAstar 中的Protean 软件预测蛋白质B、T 细胞抗原表位；利用SWISS-MODEL 预测该蛋白的三级结构[15]等。

2 结果与讨论

2.1P450基因的PCR 扩增和原核表达载体的鉴定结果以反转录得到的捻转血矛线虫的cDNA 为模板，PCR 扩增P450 基因。结果显示，获得约为678 bp 的目的片段，与预期大小一致（图1A）。对构建的重组质粒经双酶切鉴定，出现两条目的带，分别为678 bp 和5 422 bp（图1B），测序比对结果与全转录组测序得到的基因序列一致。表明正确构建了原核表达载体pET-P450。

2.2 rP450 表达的鉴定与纯化结果将构建的pETP450/BL21 经IPTG 诱导后，利用SDS-PAGE 鉴定。结果显示，在沉淀物中出现大小为31.58 ku的目的条带，而上清液中无该条带（图2A）。经Ni-NTA 柱纯化，获得了纯化的rP450（图2B）。表明，P450 基因在大肠杆菌中获得了表达，且在包涵体中表达。

图1 P450 基因的PCR 扩增（A）和重组质粒pET-P450 的双酶切鉴定（B）结果Fig. 1 The PCR product of P450 gene(A) and the dual-enzyme digestion of pET-P450(B)

图2 rP450 表达（A）以及纯化（B）的SDS-PAGE 检测结果Fig. 2 Detection of expression products of rP450(A) and purification (B)

2.3 P450 蛋白的生物信息学分析

2.3.1 P450 蛋白的理化性质分析 利用ExPASy-Prot Param 分析P450 蛋白理化性质，结果显示P450 蛋白原子总数3 625 个，分子式为C1154H1812N314O330S15，理论等电点（PI）值为5.72。该蛋白由20 种氨基酸组成，带31 个负电荷残基（Asp+Glu），带26 个正电荷残基（Arg+Lys）；其中Leu（L）含量最高为10.2%，Trp（W）含量最低为1.3%；当N 端的1 个氨基酸为M（Met）时，P450 蛋白在体外哺乳动物网状红细胞中的半衰期为30 h，在酵母体内的半衰期大于20 h，在大肠埃希菌体内的半衰期大于10 h。蛋白质不稳定系数（Instability index）为51.08，表明其是不稳定蛋白；总平均亲水性（Grand average of hydropathicity）为-0.212，为亲水性蛋白，亲水性蛋白有利于蛋白的高效率表达和抗原抗体的嵌合。

2.3.2 P450 蛋白跨膜区和信号肽的预测 利用TMH MM 预测P450 蛋白跨膜区和信号肽，结果显示该蛋白跨膜区中的氨基酸期望值约为0.0829，当期望值>18 时有跨膜区，P450 蛋白无跨膜区，蛋白全部在膜外。利用SignalP 软件对P450 蛋白的信号肽序列预测，发现其不存在信号肽。但利用SecretomeP 软件预测非典型分泌蛋白发现，P450 蛋白NN-Score=0.800（若NN-Score>0.5，判定为分泌蛋白），所以该蛋白属于分泌蛋白。结果表明，该蛋白不含有跨膜区和信号肽，属于膜外分泌蛋白，推测该蛋白可能在细胞合成后直接被分泌从而发挥生物学作用。

2.3.3 P450 蛋白的三级结构预测 利用SWISSMODEL 对P450 蛋白的三级结构进行预测，结果显示，P450 蛋白由α 螺旋、β 折叠、β 转角和无规卷曲等二级结构，经盘绕、折叠和卷曲等一系列复杂的过程形成的三级结构（图3）。

图3 P450 蛋白的三级结构预测Fig. 3 Tertiary structure prediction of P450 protein

2.3.4 P450 蛋白抗原表位的分析 在机体的免疫应答过程中，T 细胞的抗原受体（TCR）和B 细胞的抗原受体（BCR）所识别的表位特性不同，分别被称为T 细胞表位和B 细胞表位。综合3 种B 细胞抗原表位预测方法结果显示，B 细胞抗原表位分别位于P450蛋 白 的aa5～aa7、aa24～aa31、aa45～aa57、aa97～aa108、aa123～aa137、aa152～aa165、aa209～aa223 等7 个氨基酸区段。该蛋白有11 个潜在的T 细胞抗原表位，分别 位 于aa12～aa15、 aa25～aa28、 aa43～aa57、 aa68～aa77、aa81～aa87、aa103～aa106、aa135～aa138、aa165～aa174、aa196～aa200、aa206～aa210、aa213～aa217 氨基酸区间。这表明P450 蛋白具有较好的抗原性，有成为免疫诊断抗原的潜力。

P450 蛋白为亲水性膜外分泌蛋白，具有7 个潜在B 细胞抗原表位，11 个潜在T 细胞抗原表位。在机体的免疫应答过程中，抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，而捻转血矛线虫P450 蛋白有较多的抗原表位，说明其具有良好的抗原性，有望用作捻转血矛线虫耐药性诊断抗原。细胞色素P450 蛋白酶是公认的药物代谢第一相关酶，了解其相关性质及作用机制，对临床上合理、安全用药、避免药物的不良反应及充分发挥药效具有重要的意义，但是目前对于细胞色素P450 的研究多集中于哺乳动物，对于寄生虫尤其是捻转血矛线虫的研究却很少。本研究构建了原核表达质粒pETP450，表达了rP450，为捻转血矛线虫药物代谢以及耐药性产生机制的深入研究奠定了基础。