猪塞尼卡病毒VP2 ELISA 抗体检测方法的建立及初步应用

周而璇，范 慧，延君芳，姜 平，白 娟

（南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点实验室，江苏 南京 210095）

塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA），最早称为塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus SVV）。中文名有塞内卡病毒、塞内加病毒和塞尼卡病毒。SVA 属于小RNA 病毒科塞内卡病毒属成员，2002 年Hales 等首次发现于PER.C6（人胚胎视网膜细胞）细胞，并发现该病毒具有溶解人类肿瘤作用[1]。2008 年以来，加拿大和美国等西方国家先后报道该病毒感染引起的猪临床疾病，包括成年猪口腔和鼻腔溃疡、厌食、烂足、仔猪嗜睡、虚弱、发热和呕吐等[2-5]。该病毒感染主要影响育肥猪和新生仔猪，1日龄～4日龄仔猪发病率可达到70%，死亡率15%～30%；母猪发病率可达到70%～90%，但死亡率仅0.2%[6-8]。2015 年，我国广东省证实猪群存在该病，且SVVCH-01-2015 分离株与国外病毒株基因同源性为94.4%～97.1%[9]。此后，有学者相继报道我国多地出现该病。本实验室从山东省某临床发病猪群也分离获得该病毒[10]。

该病毒抗体检测方法主要有间接ELISA、竞争ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）和病毒中和试验等。ELISA 方法采用的包被抗原有VP1、VP2、VP3和3AB 蛋白等[10-13]。VP2-ELISA 方法的敏感性和特异性分别为94.2%和89.7%，优于VP1 和VP3 抗原ELISA 方法，与IFA 符合率为89%[12]。病毒中和试验的特异性和敏感性分别为99.6%和98.2%[13]。本研究采用大肠杆菌表达系统表达获得VP2 纯化重组蛋白，通过条件优化，建立了VP2 间接ELISA 抗体检测方法，并用于规模化猪场血清流行病学调查，表明2016 年～2019 年我国多个省份广泛存在该病毒感染，为我国该病防控提供了重要流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 病毒与血清SVA SVV-CH-SD 株由本实验室分离和保存；SVA VP2 单克隆抗体（MAb）和120 份SVA 阳性血清（采自SVV-CH-SD 株攻毒猪，且中和试验鉴定为阳性）由本实验室制备和保存；70 份SVA 阴性血清采自临床健康猪，且中和试验鉴定为阴性；口蹄疫病毒（FMDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清，均由本实验室保存。

2 182 份临床猪血清，为2016 年～2019 年收集自江苏、安徽、浙江、山东和江西等省份规模化猪场临床血清，-40 ℃冻存备用。

1.2 主要试剂pET-32a（+）、E. coli BL21（DE3）感受态细胞由本实验室保存；HRP 标记的金黄色葡萄球菌A 蛋白（HRP-SPA）购自博士德生物技术有限公司；TMB 显色液、限制性内切酶、T4 连接酶购自TaKaRa 公司；ECL 化学发光试剂盒购自Pierce 公司；质粒提取试剂盒购自Biomiga 公司；BSA 牛血清白蛋白购自Sigma-Aldrich 公司；96 孔酶标板购自Corning 生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成根据SVACH-02-2015 株VP2基因序列（KX173339.1）利用Primer5.0 软件设计一对引物，预期扩增片段长度为852 bp：SVA-VP2-F：5'- CGCGGATCCGATCACAATACCGAAGAAATGGAAA ACTCTGC-3'/SVA-VP2-R：5'-ATACTCGAGCTGTTC CTCGTCCGTCCCG-3'，下划线分别为BamH I 和Xho I酶切位点。引物由金斯瑞生物技术有限公司委托合成。

1.4 重组蛋白的诱导表达及纯化提取SVA SVVCH-SD 株RNA，反转录为cDNA，以其为模板，采用针对VP2 基因PCR 引物扩增VP2 基因，PCR 产物纯化回收后克隆至pET-32a（+）载体，获得重组质粒pET-32a-VP2，经酶切和测序鉴定正确后转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞。37 ℃震荡培养至对数期后，加入终浓度为1 mmol/L IPTG 诱导表达5 h。菌液离心后，收集菌体，用15 mL PBS 重悬，超声裂解并离心后，分别收集上清和沉淀，采用SDSPAGE 分析蛋白表达形式。将获得的重组蛋白用Ni柱纯化处理，以SVA VP2 MAb（1∶200）为一抗，山羊抗鼠Ig-HRP（1∶1 000）为二抗，western blot 鉴定VP2 蛋白与SVA 血清的反应原性。大量制备获得纯化重组VP2 蛋白，经BCA 法测定蛋白浓度，-70 ℃冻存备用。

1.5 间接ELISA 反应条件优化采用方阵滴定法分别对间接ELISA 的VP2 蛋白抗原包被浓度（4 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL）、血清稀释度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400）、包 被 时 间（4 ℃过 夜、37 ℃孵育2 h+4 ℃过夜、37 ℃孵育1 h+ 4 ℃过夜）、封闭试剂（5% BSA、1% BSA、5%脱脂乳）、封闭时间（3 h、2 h、1 h）、血清作用时间（30 min、45 min、60 min）、HRP-SPA 稀 释 度（1∶5000、1∶10 000、1∶15 000）和反应时间（30 min、45 min、60 min）、TMB显色时间（4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min），进行优化，以P/N 值（阳性血清OD450nm/阴性血清OD450nm）最大时的反应条件为ELISA的最佳反应条件。

1.6 ELISA 阴阳性临界值的确定采用上述优化的ELISA 方法检测70 份SVA 抗体阴性的临床猪血清样品，设定SVA 阴阳性血清对照，测定各血清的OD450nm值。计算S/P 值，S/P=（样品血清OD450nm值-阴性血清OD450nm值）/（阳性血清OD450nm值-阴性血清OD450nm值）。计算S/P 值平均值和标准差（-X 和SD）。按照S/P 值≥-X +3SD 时为判定血清抗体阳性，S/P 值<-X +2SD 时为阴性；介于两者之间判为可疑。

1.7 特异性试验利用本实验已建立的ELISA 方法对FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV、PRV 阳性血清抗体进行检测，以SVA 阳性血清为阳性对照，SVA 阴性血清为阴性对照，检测该方法的特异性。

1.8 敏感性试验选取120 份SVA 阳性血清，用PBS 做1∶100 稀释，采用优化的VP2 间接ELISA 方法检测，测定OD450nm，根据S/P 值判定血清抗体阴阳性，计算阳性血清检出率，分析该方法敏感性。

1.9 重复性试验批内重复试验采用同批包被抗原的ELISA 酶标板对5 份抗体水平不同的猪SVA 阳性血清进行检测，重复3 次试验。批间重复试验采用3 批抗原包被的酶标板，分别检测5 份抗体水平不同的猪SVA 阳性血清SVA 抗体，计算S/P 值及其变异系数。

1.10 符合率比较试验选取112 份临床猪血清样本（从SVA 猪场随机采集），参照FMDV 微量血清中和试验（SN/T 1181.2-2003）进行血清SVA 中和试验（SN），中和抗体效价<1∶4 判定为阴性，≥1∶4 为阳性，同时利用建立的SVA 间接ELISA 方法检测这112 份猪血清。结果判定以SN 试验为标准，分析两种方法符合率。符合率（%）=[（阳性数+阴性数）/检测总数]×100%。

1.11 华东地区猪SVA 流行病学调查利用本实验建立的VP2 间接ELISA 检测方法对2016 年～2019 年度我国华东地区江苏、浙江、山东、安徽、江西等地2 070 份血清进行检测，每个样品重复3 次，取其OD450nm平均值，分析华东地区SVA 的流行状况。

2 结 果

2.1 目的基因克隆、表达与纯化以SVA 反转录得到的cDNA 为模板，PCR 扩增获得大小为852 bp的VP2 基因，构建重组质粒pET-32a-VP2，目的基因测序正确。转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞，IPTG 诱导后，经SDS-PAGE 检测，重组菌pET-32a-VP2/DE3 经诱导后在55 ku 出现目的条带（图1A）。表明目的蛋白获得了表达，且主要以包涵体的形式存在，制备获得纯化重组蛋白大小约55 ku，west⁃ern blot 结果显示在55 ku 处出现特异条带（图1B），表明重组VP2 蛋白具有反应原性。

图1 SVA VP2 重组蛋白SDS-PAGE（A）和western blot（B）鉴定Fig. 1 SDS-PAGE(A) and western blot(B) identification of SVA VP2 recombinant protein

2.2 间接ELISA 反应条件优化结果采用方阵滴定法确定了重组VP1 蛋白包被浓度和待检血清稀释倍数，在此基础上对其他各个反应条件进行优化，结果显示最佳反应条件为：抗原最佳包被浓度为1 μg/mL，37 ℃孵育2 h 后4°过夜；5%脱脂乳溶液37 ℃封闭3 h；待检血清1∶100 稀释，37 ℃反应30 min，HRP-SPA 1∶15 000 稀释，37 ℃作用30 min，加入TMB 显色液，37 ℃避光显色10 min，最后测定OD450nm值。

2.3 临界值的确定利用该方法检测70 份阴性猪血清，平均OD450nm值为0.228，阳性对照平均OD450nm为1.034。S/P 平均值和标准差分别为-X=0.053，SD=0.059。根据统计学原理，S/P（样本）≥-X+3SD=0.227时为阳性，S/P（样本）<-X+2SD=0.171 时为阴性，介于两者之间时判为可疑（图2）。

图2 SVA VP2 ELISA 抗体阴性血清正态分布分析Fig. 2 Analysis of the negative serums against SVA VP2 with ELISA

2.4 特异性试验结果利用该方法检测5 种猪病原抗体阳性血清，结果均为阴性（表1），表明该蛋白与FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV 和PRV 阳性血清抗体均无交叉反应，SVA 阴阳性对照均成立。表明该方法特异性较强。

表1 SVA VP2 间接ELISA 方法特异性试验结果Table 1 SVA VP2 indirect ELISA method specific test results

2.5 敏感性试验结果取120 份SVA 人工感染猪SVA 抗体阳性血清，采用本研究建立的ELISA 方法检测，结果有110 份血清抗体阳性，阳性血清检出率为91.6%。表明该方法敏感性较高。

2.6 重复性试验结果选择5 份猪血清分别进行批内和批间重复检测3 次，结果显示，批内重复试验变异系数为3.12%～11.1%，批间变异系数为2.98%～9.67 %，批内和批间变异系数均小于12%（表2），表明该方法具有较好的重复性。

2.7 符合率试验结果利用本研究建立的间接ELI⁃SA 和SN 试验同时检测112 份临床猪血清样本，结果显示，两种方法的符合率为91.9%（表3）。表明该方法与SN 试验符合率较高。

图3 敏感性试验结果Fig. 3 Sensitivity test results

表2 SVA VP2 间接ELISA 方法重复性试验结果Table 2 SVA VP2 indirect ELISA method repeatability test

表3 SVA VP2 间接ELISA 抗体检测方法与SN 试验结果比较Table 3 Comparison of SVA VP2 indirect ELISA antibody detection method and SN test results

2.8 华东五省份血清流行病学调查结果采集2016年～2019 年华东地区5 省份规模猪场血清2 070 份，采用本研究建立的VP2 ELISA 方法检测。结果显示，2016 年～2019 年华东地区猪场SVA 抗体阳性率为70.8%，各省抗体阳性率均达67%以上。而且，2017 年～2019 年血清抗体阳性率变化趋势基本一致（表4），表明本实验建立的ELISA 方法可以用于临床血清学检测，同时表明SVA 于2016 年前已经在我国多地感染并流行。

表4 2016 年～2019 年5 个省份规模化猪场猪血清SVA ELISA 抗体检测结果Table 4 ELISA results of anti-SVA antibody of pig serum from large scale pig farms in 5 provinces in 2016 to 2019

3 讨 论

SVA 基因组约为7.2 kb，包含一个开放阅读框（ORF），编码2 181 个氨基酸（aa）多蛋白，一个668核苷酸（nt）5'非翻译区（UTR）和一个71-nt 3'UTR。其中编码2 181 个氨基酸的开放阅读框，由12 个蛋白（LPRO、VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D）构成[1-2,4]。SVA 的B 细胞表位主要存在于VP1、VP2 和VP3 蛋白。SVA 感染早期即可产生较强病毒中和抗体反应。VP2 特异性IgM 抗体反应与SVA 感染后的早期中和抗体水平相关。由于VP2 包含SVA 的免疫显性T 细胞表位，VP2 诱导的CD4+T 细胞数量和CD4+T、CD8+T 细胞反应均高于VP1[14-15]。Dvorak 等在进行大量血清样品检测后，发现单独包被VP2 抗原ELISA 板的敏感性和特异性均高于VP1 和VP3[13]。本研究利用大肠杆菌表达系统成功表达并制备获得反应性较好的VP2 重组蛋白，建立了VP2 蛋白间接ELISA 抗体检测方法。该方法与CSFV、PRRSV和PCV2抗体均无交叉反应性，敏感性达91.6%，与中和抗体试验符合率达91.9%。

血清学回顾性研究有助于全面了解地区病毒的感染情况，如Saporiti 等利用中和试验对2007 年～2016年巴西不同猪场进行了血清学回顾性研究，发现2014 年前巴西主要猪场不存在SVA 感染，2014 年～2016 年 间SVA 抗 体 阳 性 率 为36.4%[16]。2015 年 以来，我国广东、湖北、河南和辽宁等多省份已确诊多例SVA 感染猪群[9-10]。本研究采用该方法对2016年～2019 年华东地区江苏、山东、浙江、安徽和山西5 个省市规模化猪场临床血清进行了回顾性血清抗体检测，结果显示，2016 年～2019 年各省份SVA抗体阳性率达70.8%以上，证明我国多个省份规模化猪场均已存在SVA 感染，与范慧等报道的结果基本一致[12]。目前我国该病尚未列入官方动物疫病监控计划，也缺少商品化ELISA 抗体检测试剂盒和免疫防控方法。本研究为我国塞内卡病的诊断和防控提供参考。