黑龙江某规模化牛场副结核分枝杆菌的分离与鉴定

蔡珠明，党光辉，臧鑫鑫，邵明珠，唐阳阳,2，崔子寅，宋宁宁，刘思国*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118）

副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis，MAP）是胞内寄生的革兰氏阳性病原菌，也称禽分枝杆菌副结核分枝杆菌亚种，属于禽分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex，MAC）成员，为致病性的非结核分枝杆菌[1]，基于全基因组测序的系统进化分析，将MAP 分为3 种亚型，即C 型（牛型）、S 型（羊型）和B 型（野牛型）[2]。MAP 主要引起反刍动物的副结核病（Paratuberculo⁃sis，pTB），又称约内氏病（Johne's disease，JD），为一种慢性、接触性肠道增生性传染病，潜伏期长，临床表现为持续性腹泻、体重迅速减轻，并最终导致消耗性死亡[2]，该病严重威胁着奶牛养殖业的健康发展。奶牛主要通过接触感染牛的乳汁或粪便感染[3-4]。在兔、狐狸、白鼬和鼬鼠等许多非反刍野生动物中也能分离到MAP[5]。自从1913 年Dalziel 等首次描述牛约内氏病与人类克罗恩病（Crohn's dis⁃ease，CD）的相似性以来[6]，MAP 感染与克罗恩病的关系受到广泛关注。Martin 等通过28 个病例对照研究证实了MAP 与克罗恩病之间具有特定关联[7]。因此对于pTB 的流行病学研究势在必行。

2019 年5 月，本研究从黑龙江某规模化牛场采集35 头患副结核牛的直肠刮取物，通过PCR 鉴定和MAP 的分离培养，结果表明31 份为MAP 感染，本实验为进一步病原学和分子流行病学的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品及菌株黑龙江某牛场副结核病抗体阳性牛的直肠刮取物样品35 份。禽分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. Avium，MAA）-血清II 型（CVCC276）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；胞 内 分 枝 杆 菌（Mycobacterium intracellulare，MI，ATCC13950）购 自ATCC；MAP K-10（ATCC BAA-968）参考菌株由本实验保存。

1.2 主要试剂氯代十六烷基吡啶（HPC）、萘啶酮酸钠盐（Naladixicacid）、万古霉素、两性霉素B 均购自美国Sigma-Aldrich 公司； 脑心浸液培养基（BHI）、Herrold's Egg Yolk Agars、7H9 液体培养基均购自美国BD 公司；分枝杆菌素购自美国Allied Mon⁃itor 公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、粪便基因组DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq DNA Polymerase 和PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均 购 自TaKaRa 公 司。

1.3 引物设计与合成参照文献[8]合成检测IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA 的多重PCR引物，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

1.4 直肠刮取物样品的PCR 检测及细菌的分离培养称取直肠刮取物样品5 g～8 g，加35 mL 灭菌水震荡混匀，300 r/min 室温离心5 min 后将上清再次离心5 min，取2 mL 上清室温12 000 r/min 离心15 min后保留上清用于细菌的分离培养，沉淀采用粪便基因组DNA 提取试剂盒提取总基因组。以提取的基因组DNA 为模板、MAP K-10 的基因组为阳性对照、灭菌水为阴性对照，采用IS900 引物进行PCR 鉴定，反应程序如下：95 ℃5 min；95 ℃60 s、60 ℃40 s、72 ℃35 s，30 个循环；72 ℃10 min。PCR 扩增阳性的样本用于细菌的分离培养，采用改良的NADC 法[9]，将PCR 结果为阳性的样品上清处理后取0.1 mL 悬液接种于Herrold's Egg Yolk Agars 的斜面培养基上。

1.5 分离菌的多重PCR 鉴定挑取Herrold's Egg Yolk Agar 培养基上的单菌落接种于7H9 液体培养基（10% OADC，0.2% Tween-80，0.05%甘油，2 mg/L Mycobactin J）中，100 r/min 摇床37 ℃培养28 d。收集5 mL 菌体用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取基因 组。以IS900、IS901、DT1、IS1311 和16S rRNA 5 对引物进行多重PCR 鉴定。反应程序：95 ℃8 min；95 ℃59 s、60 ℃40 s、72 ℃35 s，30 个循环；72 ℃10 min。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 分离菌MAP 的遗传进化分析及亚型鉴定采用IS1311 引物，利用PrimeSTAR 聚合酶对提取的分离株MAP 基因组进行PCR 扩增，反应程序为：98 ℃10 s； 98 ℃10 s、60 ℃5 s、72 ℃5 s，30 个循环，72 ℃1 min。PCR 产物纯化后由吉林省库美生物有限公司测序，测序结果在NCBI 网站采用BLAST 进行同源性比对，利用MegAlign 软件进行MAP IS1311 基因序列核苷酸同源性分析并构建遗传进化树。利用Snapgene 软件查找分析酶切位点，参照Godfroid 等报道的MAP-IS1311 多态性的分型方法[10]，查找PCR 产物—IS1311 基因上的酶切位点，对鉴定为MAP 的菌株进行亚型鉴定。

2 结果与讨论

2.1 直肠刮取物样品的PCR 检测与MAP 的分离培养从35 份MAP 血清抗体阳性牛的直肠刮取物样品中提取基因组，经IS900-PCR 鉴定后，显示31 份为阳性（图1A），表明有31 头奶牛向外排菌。造成检测结果差异的原因如下：其一是由于牛处于MAP 感染的早期，仅有抗体升高，还没有向外排菌；其二是直肠刮取物中MAP 菌体数量太少，由于PCR 敏感性问题无法检测到；其三是ELISA 结果出现假阳性结果。两种检测方法的互为补充提示在以后的流行病学调查中要同时检测抗体和抗原以确保检测的准确性。将鉴定为阳性的样品，处理后接种于Herrold's Egg Yolk Agars 培养基上，30 d 后，观察到编号为HLJB160、HLJB175 和HLJB177 样品的培养基上长出菌落，起初（40 d）观察到呈点状分布、乳白色半透明，边缘平滑有光泽的小菌落，随着培养时间的延长，菌落变大，直至培养至100 d 观察到菌落由半球状转为乳头状（图1B）。从31 份PCR 阳性的直肠刮取物样品中总共分离培养出3 株MAP，分离率为9.7%（3/31）。31 份经IS900鉴定为阳性的样品中仅3份有菌落生长，这是由于MAP 对生长条件有着非常苛刻的要求，在体外分离培养的过程中需要依赖分枝杆菌素的作用维持其生长，同时菌量的多少、直肠采样的深浅及直肠刮取物中复杂的杂菌污染等给MAP的分离带来了挑战[11]，这可能是本次分离株少的主要原因。

2.2 分离菌的多重PCR 鉴定结果将3 株分离菌挑取单菌落扩大培养28 d 后利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取基因组，以5 对鉴定引物进行多重PCR 扩增，结果显示，3 株分离菌均扩增得到约398 bp、484 bp 和608 bp 的3 条目的条带，分别与IS900、16S rRNA、IS1311 3 个基因片段的大小一致，扩增条带与MAP K-10标准株相一致（图2）。结果表明3株分离菌均为MAP，将它们分别命名为MAP-HLJB160、MAPHLJB175、MAP-HLJB177。多重PCR方法相较于分离培养方法更加快捷，并且在分枝杆菌检测中具有灵敏度更高、特异性更强的特点，本结果是对前文结论的进一步论证和支持。

图1 直肠刮取物PCR 鉴定结果（A）和分离株的生长情况（B）Fig. 1 Rectal scrape PCR identification results (A) and the growth of isolate strains (B)

图2 副结核分枝杆菌分离株多重PCR 鉴定结果Fig. 2 Identification of the MAP isolates by multiplex PCR

2.3 MAP 分离菌的遗传进化分析及亚型鉴定结果对3 株MAP 分离菌的IS1311 PCR 产物测序结果在NCBI 网站采用BLAST 进行同源性比对，结果显示3 株MAP 分离菌IS1311 基因序列之间100%同源，利用MegAlign 软件进行MAP IS1311 基因序列同源性分析，结果显示IS1311 基因序列与GenBank 中的多个MAP 相应基因序列同源性在99.8%以上，构建该基因遗传进化树结果显示，HLJB160、HLJB175 和HLJB177 与CP015495.1（MAP/TANUVAS/印度/2008）、CP033911.1（MAPK_JB16/15/韩国/2018）和CP005928.1（MAP4/美国/2014）等多株MAP 在遗传进化上具有高度的亲缘性。利用Snapgene 软件查找到3 株分离菌均含有牛型MAP 特有的两个Hinf I（218 位和285 位）酶切位点（图3B），与Godfroid 等报道的牛型MAP 特征相一致，表明本实验分离的MAP-HLJB160、MAPHLJB175、MAP-HLJB177均为牛型MAP。

图3 分离菌MAP 的遗传进化分析及亚型鉴定结果Fig. 3 Genetic evolution analysis and subtype identification of MAP isolates

国内外均有MAP 分离鉴定的报道。Grant 等从犊牛的代乳粉中分离得到MAP 并进行遗传进化分析[12]。Galiero 等在意大利北部的野生马鹿中分离得到19株MAP，全部是牛型，并进行了基因分型研究[13]。Marina 等首次从巴西的山羊中分离出MAP 菌株，并鉴定属于牛型MAP[14]。彭永等对山东省75头ELISA阳性牛的粪便样品分离培养，共分离到4 株MAP，IS1311 特异性片段验证及双酶切分型鉴定确定4 株分离菌均为羊型MAP[15]。

对MAP 准确的分离与鉴定是后续对其进行一系列分子水平研究的前提。本实验分离鉴定得到3 株牛型MAP，对黑龙江某牛场的牛群健康状况进行了考察，为该场之后对该疫病的防控提供参考。