胃癌组织中miR-30a、FAP-α的表达变化及其临床意义

马秀丽，陈庆明，陈登荣，张洁民，刘伟昌，王精忠，李泽凯

1 武威市人民医院，甘肃武威733000；2 遂宁市中医院；3 兰州大学第一医院

2018 年全球胃癌的新发病例数为103 万左右，占癌症新发病例数的5.7%。胃癌死亡例数为78 万左右，占比8.2%。目前胃癌的发生率排在恶性肿瘤第5 位，病死率排在第3 位，严重影响人们的生命健康［1］。早期胃癌的预后较好，并且治愈率较高［2］。而中晚期胃癌预后较差，容易发生远端转移和复发，导致患者的生存期缩短，因此提高早期胃癌的检出率对于胃癌患者的治疗以及预后改善尤为重要［3］。目前对于胃癌的发病机制仍然缺乏了解，已有的研究报道显示在胃癌发病过程中多种微小RNA（miR⁃NA）表达量异常［4］。miRNA 是在细胞内广泛存在的微小RNA 分子，通过碱基互补配对与基因的mRNA结合并促进其降解，从而导致基因表达水平下降［5］。微小RNA-30a（miR-30a）在细胞核和细胞质中均有分布，在卵巢癌和结直肠癌中表达下调，与肿瘤细胞的侵袭和迁移密切相关［6-7］。成纤维细胞活化蛋白-α（FAP-α）是一种膜蛋白分子，主要分布于细胞膜上，具有丝氨酸蛋白酶活性［8］。FAP-α 在乳腺癌和甲状腺乳头状癌中表达上调，参与调节肿瘤细胞的侵袭迁移以及上皮—间质转化等过程［9-10］。已有研究报道显示，在肺成纤维细胞发育成熟过程中，miR-30a能够负向调节FAP-α 表达，提示在机体内miR-30a与FAP-α表达存在相关性［11］。本研究通过检测胃癌患者癌组织以及癌旁组织中的miR-30a、FAP-α，旨在探讨其在胃癌组织中表达变化及其与胃癌患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2018 年 3 月—2020 年 2 月在武威市人民医院治疗的96例胃癌患者。纳入标准：在入院之前未接受过放化疗；不存在自身免疫性疾病；不存在感染性疾病；经病理学诊断确诊为胃癌。排除标准：存在严重肝肾功能障碍；不适宜进行胃癌根治术治疗；合并有其他类型肿瘤；存在自身免疫性疾病。患者男 54 例，女 42 例；年龄 42～72（61.69 ±12.74）岁；其中 TNM 分期Ⅰ期 13 例，Ⅱ期 22 例，Ⅲ期 35 例，Ⅳ期 26 例；肿瘤直径：≤3 cm 39 例，>3 cm 57 例；浸润深度：黏膜层 49 例，黏膜下层 47 例；肿瘤分化程度：低、中、高分化分别为54、29、13 例；发生淋巴结转移65 例。患者在入院后均行胃癌根治手术治疗，收集手术过程中切除的患者肿瘤组织及相应的癌旁组织（距离肿瘤组织5 cm 以上）。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有患者知情同意。

1.2 组织中miR-30a 表达检测 在胃癌组织及癌旁组织样本中加入1 mL 的TRIzol 裂解液，室温裂解30 min 后用于miR-30a 检测。采用mirVana miRNA提取试剂盒（美国赛默飞世尔科技有限公司）提取组织中的总RNA。采用miRcute 增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）对miRNA 进行逆转录。逆转录体系：5µL 总RNA，10 µL 逆转录缓冲液，2 µL 逆转录酶，3 µL 蒸馏水。逆转录条件：42 ℃，60 min；95 ℃，3 min。采用miR⁃cute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒对miR-30a进行荧光定量检测。反应体系：10µL SYBR缓冲液，0.5µL正向引物，0.5µL反向引物，1µL cDNA，8µL蒸馏水。反应条件：94 ℃，20 s；50 ℃，30 s，35个循环。miR-30a 上游引物序列：5"-GTTGAGCTCTTGCTCCAGCC-3"，下游引物序列：5"-CGTGGATCAGTTTCCTG-3"；内参基因选择U6，U6上游引物序列：5"-CTTCAATCA⁃GATAGCCAGCAT-3"，下游引物序列：5"-AGCCAGTTC⁃GTTGTGAGATAAC-3"。 采 用 2-ΔΔCt计 算 miR-30a 的相对表达量。

1.3 组织中FAP-α 表达检测 手术过程中切除样本后立即进行常规中性甲醛（上海德金科技有限公司）固定，梯度乙醇脱水后通过生物组织包埋机（美国倍安特医疗设备有限公司）进行常规石蜡包埋，制备成组织芯片。组织芯片脱蜡水化，使用3%过氧化氢（广东恒健制药有限公司）在37 ℃湿盒中孵育20 min，随后在高压锅中进行抗原修复，封闭液37 ℃孵育30 min。孵育结束后滴加anti-FAP-α 抗体（Acam 生物科技有限公司）过夜。次日滴加二抗37 ℃孵育30 min，最后经二氨基联苯胺（四川柯基圣科技有限公司）法显色，苏木精（上海恒景生物工程有限公司）复染、脱水、透明和固定，荧光倒置生物显微镜（德国德意克医疗器械有限公司）下观察染色结果。细胞阳性数阳性比例≤5%为0 分，5%<阳性比例<25%为1 分，25%≤阳性比例<50%为2 分，50%≤阳性比例<75%为3 分，阳性比例≥75%为4 分。染色强度分为无色（0分），淡黄色（1分），棕黄色（2分）和棕褐色（3 分）。将阳性细胞数评分和染色强度评分乘积作为最终评分，分为阴性（0～4）和阳性（5～12）［12］。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Spearman 相关性分析胃癌组织中miR-30a 和FAP-α 表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中miR-30a、FAP-α 表达比较 胃癌组织中miR-30a 相对表达量为12.57 ±3.58，低于癌旁组织中的 20.99 ± 4.17（P<0.05）。96 例胃癌组织中FAP-α 阳性 80 例（83.33%），阴性16 例（16.67%）；96 例癌旁组织中FAP-α 阳性23 例（23.96%），阴性73例（76.04%）；两者FAP-α阳性比例比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 胃癌组织中miR-30a、FAP-α 表达与患者临床病理特征的关系 胃癌组织中miR-30a、FAP-α的表达与淋巴结转移和 TNM 分期有关（P均<0.05），与年龄、性别、浸润深度、肿瘤直径和组织学分化无关（P>0.05）。见表1。

2.3 胃癌组织中miR-30a 和FAP-α 表达的相关性 胃癌组织中miR-30a 和FAP-α 的表达呈负相关（r=-0.872，P<0.05）。

3 讨论

胃癌是临床上较为常见的消化道恶性肿瘤，患者病死率较高，并且预后较差［13］。目前临床上对胃癌的发病机制仍然缺乏了解，已有研究报道显示肿瘤免疫逃逸、肠道微生物菌群失调、miRNA 调控紊乱以及促癌基因突变活化等因素均会造成胃癌的发生，其中miRNA 调控机制在胃癌诊断和治疗中的临床价值得到广泛关注［14-15］。细胞内存在复杂的miR⁃NA 调控机制，单个miRNA 能够同时调节多个基因mRNA 的转录和翻译，并且不同的miRNA 之间也能够结合并调节彼此之间的表达水平，在细胞分裂、分化、代谢和信号转导等细胞活动过程中能够发挥精细的调节作用［16］。因此，寻求与胃癌发生发展密切相关的miRNA 并将其应用于胃癌的诊断和治疗中是今后胃癌研究的方向。

表1 胃癌组织中miR-30a、FAP-α的表达与患者临床病理参数的关系

miR-30a 表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。miR-30a 在肺癌和宫颈癌等肿瘤中表达下调，使得下游靶基因如MEF2D等促癌基因表达上调，促进肿瘤进展［17-18］。本研究发现，在胃癌组织中miR-30a 表达下调，并且其表达与淋巴结转移和TNM 分期相关，表明miR-30a 在胃癌中可能起到抑癌基因的作用，并且与胃癌的恶性程度有关。分析其原因可能是由于miR-30a 参与调节肿瘤上皮—间质转化以及胞外基质降解。已有研究发现Snail 基因是miR-30a的作用靶点，miR-30a与Snail基因mRNA 结合促使Snail的mRNA大量降解，从而导致Snail表达水平下调。Snail 是肿瘤相关转录因子，下游靶基因多参与肿瘤上皮—间质转化，Snail 表达与肿瘤上皮—间质转化和肿瘤转移密切相关，Snail 表达水平下调会导致肿瘤细胞转移和侵袭能力下降［19］。同时有研究发现miR-30a 能够抑制无翅基因（Wnt）信号通路的活化。基质金属蛋白酶2 和基质金属蛋白酶9是Wnt 信号通路的下游靶基因，由于基质金属蛋白酶具有蛋白酶活性，其能够分泌至细胞外基质并催化胞外基质蛋白的降解［20］。因此胃癌中miR-30a 表达下调能够促进Wnt 信号通路的活化，进而上调基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达，使得胞外基质中胶原蛋白以及纤维蛋白等介导细胞间黏附蛋白被大量降解，引起胃癌细胞之间以及胃癌细胞与周围正常组织细胞之间的黏附下降，胃癌细胞发生转移而导致胃癌恶性程度较高。

FAP-α 是一种呈纤维细胞活化蛋白，本身具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶活性，能够磷酸化修饰具有丝氨酸和苏氨酸两种氨基酸的蛋白质和多肽，参与调节细胞分裂、细胞骨架形成以及胞外基质分泌等过程［21］。已有研究表明FAP-α表达异常与肿瘤进展密切相关，在食管鳞状细胞癌和胃癌等肿瘤中表达上调，能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移，进而促进肿瘤进展［22-23］。本研究发现在胃癌组织中FAP-α 阳性表达率明显升高，并且其表达与淋巴结转移和TNM分期相关，表明胃癌中FAP-α 表达也与胃癌的恶性程度相关。分析其原因可能是由于FAP-α参与肿瘤血管生成以及肿瘤免疫逃逸。CAO 等［24］研究发现，FAP-α 能够激活丝氨酸—苏氨酸激酶信号通路，进而促进肿瘤血管生成。肿瘤血管是肿瘤转移的主要途径，并且能够为转移的肿瘤细胞提供营养物质和氧气以满足肿瘤细胞增殖的需求。血管内皮生长因子是丝氨酸—苏氨酸激酶信号通路的下游靶基因，肿瘤细胞通过向肿瘤微环境中释放血管内皮生长因子以诱导肿瘤血管的生成［25］。因此胃癌中FAP-α表达上调能够活化丝氨酸—苏氨酸激酶信号通路，进而上调血管内皮生长因子表达并将其释放至细胞外以诱导肿瘤血管生成，胃癌细胞进入肿瘤血管并实现转移。同时，WEN 等［26］研究发现，FAP-α 能够抑制机体的免疫功能。机体能够通过细胞免疫和体液免疫两个过程清除肿瘤细胞，机体免疫功能下降与肿瘤转移和增殖关系密切。已有研究报道显示，FAP-α能够与T淋巴细胞表面的T细胞受体结合，进而抑制T淋巴细胞活化［27］。因此胃癌细胞膜表面分布大量的 FAP-α 蛋白，其与 T 淋巴细胞表面的T 细胞受体结合，进而抑制T细胞受体信号通路的活化，导致胃癌细胞发生转移。

进一步研究结果显示，胃癌组织中miR-30a 和FAP-α 表达呈负相关，分析其原因可能是由于两者在胃癌中存在负调控机制。miRNA 主要通过与目标基因的mRNA 结合介导其降解，因此推测在胃癌中 miR-30a 可能能够与 FAP-α 基因的 mRNA 结合并促进其降解，从而下调FAP-α 表达。由于胃癌中miR-30a 表达下调，因此 miR-30a 对 FAP-α 基因表达的抑制作用解除，从而导致胃癌组织中FAP-α 表达阳性率高。对于miR-30a 和FAP-α 之间的调控分子机制仍然需要后续研究进行深入探讨。

综上所述，胃癌组织中miR-30a表达下调，FAP-α阳性表达率升高，胃癌组织中二者表达呈负相关，并且均与肿瘤淋巴结转移和TNM分期有关。