膀胱癌组织中miR-130a-3p、SPOCK1 表达变化及意义

王浩 ，郭丰富

1 山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床医学院，山东泰安271000；2 临沂市人民医院

膀胱癌（BC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，病理类型以膀胱移行细胞癌最常见。全球每年BC 新发病例数达40万，并且其发病率及病死率有逐渐上升的趋势［1］。目前BC 治疗包括根治手术治疗、放化疗及免疫治疗等，但由于肿瘤异质性较大，患者术后易出现局部复发和远处转移，严重威胁患者生命［2］。因而，有必要研究BC的发病机制，寻找新的BC的肿瘤标志物。微小RNA（miRNA）是细胞内无蛋白编码功能的具有短发夹结构的RNA 分子，长度为19～25个核苷酸，其参与构成RNA 诱导的沉默复合物结合靶基因mRNA 的3"非编码区，促进靶基因mRNA的降解，从而转录后调控靶基因的表达，参与胚胎发育、增殖、凋亡、代谢及肿瘤发生等病理生理过程［3］。miR-130a-3p 基因位于11q12.1，可通过碱基互补配对的方式识别靶基因如c-Met 的mRNA，抑制c-Met的翻译，发挥抑癌基因的作用［4］。研究发现，miR-130a-3p 在肾细胞癌［4］、乳腺癌［5］及鼻咽癌［6］等肿瘤中表达降低，并促进肿瘤的增殖、迁移能力。睾丸蛋白聚糖（SPOCK1）基因位于5q31.2，编码血浆蛋白聚糖的蛋白核心，参与构成硫酸软骨素和乙酰肝素的肽链，功能上发挥半胱氨酸蛋白酶抑制剂的作用。近年来研究表明，前列腺癌［7］、肺癌［8］等多种肿瘤中SPOCK1 的高表达能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，导致肿瘤细胞的增殖及浸润能力增强。有学者在肺肿瘤细胞系A549 中发现，miR-130a-3p的表达上调能够显著抑制SPOCK1 的表达，进而降低肿瘤细胞的浸润及迁移能力［9］。因此，miR-130a-3p 与SPOCK1 可能是影响肿瘤发生发展的重要机制。本研究通过检测BC 组织中miR-130a-3p、SPOCK1的表达，初步探讨两者的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年10月—2020年6月在我院诊治的BC 患者94 例。纳入标准：初次诊治；经病理活检诊断为BC；以往无其他恶性肿瘤病史，无放化疗及靶向治疗史。排除标准：伴有神经源性膀胱、膀胱挛缩等疾病；合并严重泌尿生殖系统感染或膀胱结核感染；合并精神障碍性疾病，不能配合治疗。其中男 55 例、女 39 例；年龄 32～78（46.6 ±6.1）岁；病理分级：高级别 38 例，中低级别56 例；病理类型：移行细胞癌85 例，非移行细胞癌9 例，其中鳞癌4 例，腺癌5 例；肿瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期32例；合并淋巴结转移33例，不合并淋巴结转移61 例；合并远处转移14 例，不合并远处转移80例。本研究经我院伦理委员会审核通过，且患者均知情同意并签字。

1.2 组织中miR-130a-3p、SPOCK1 表达检测 采用荧光定量PCR。取BC肿瘤组织及癌旁组织（距肿瘤边缘2 cm 以上，经病理检查明确为正常膀胱黏膜组织）10 mg，应用总RNA 提取试剂盒（北京天根公司）提取组织中总RNA，Narodrop 检测总RNA 的浓度和纯度，OD260/OD280介于1.8～2.1。应用反转录试剂盒（北京天根公司）将总RNA反转录合成cDNA。miR-130a-3p 荧光定量 PCR 反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 4 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；反应体系：2×SYBR Premix 10 µL，上下游引物各1µL，cDNA 1 µL，ddH2O 7 µL。SPOCK1 反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；反应体系：2×SYBR Premix 10 µL，上下游引物各1µL，cDNA 1µL，ddH2O 7µL。miR-130a-3p以U6为内参，U6正向序列：5"-AAAGTGGCTAAACGAAGCTGAA-3′，反向序列：5"-GTGGGCAGTGGGTTCTTCTC-3"。SPOCK1 以GAPDH 为内参，正向序列：5"-CTGGGCTACACT⁃GAGCACC-3"，反 向 序 列 ：5"-AAGTGGTCGTT⁃GAGGGCAATG-3"。 采 用 2-ΔΔCt法计 算 组织 中 miR-130a-3p、SPOCK1的相对表达量。

1.3 miR-130a-3p 与SPOCK1 的结合位点预测 采用 TargetScan Human7.2 在线软件（http：//www.tar⁃getscan.org/vert_72/）对miR-130a-3p与SPOCK1的潜在结合位点进行生物信息学预测。结果显示miR-130a-3p 与SPOCK1 存在潜在的互补结合位点，见图1。

图1 miR-130a-3p与SPOCK1的结合位点

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，组间比较用t检验；计数资料比较采用 χ2检验；miR-130a-3p 与 SPOCK1 相对表达量的相关性用Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BC 癌组织及癌旁组织中miR-130a-3p 与SPOCK1 表达比较 BC 癌及癌旁组织中miR-130a-3p 的相对表达量分别为 0.448 ± 0.107、1.120 ±0.208，SPOCK1 mRNA的相对表达量分别为1.763±0.315、0.370± 0.083，两者相比P均<0.05。

2.2 BC 癌组织中 miR-130a-3p 与 SPOCK1 mRNA表达的关系 BC 癌组织中miR-130a-3p 与SPOCK1 mRNA的表达呈负相关（r=-0.621，P<0.05）。

2.3 BC 癌组织中 miR-130a-3p、SPOCK1 表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

3 讨论

BC是常见的泌尿生殖系统的肿瘤，世界上每年新发病例达 35.6 万例，死亡例数达 14.5 万例［10］。BC常见的病理类型有膀胱移行细胞癌、鳞癌及腺癌等，其中以膀胱移行细胞癌较为常见。目前BC的治疗包括手术治疗、放化疗及生物治疗等，但高级别高分期的患者预后不佳，长期生存时间较短［11］。因此，深入研究BC的发病机制，对临床诊断及治疗具有重要的意义。BC疾病的发生是一个多步骤、多阶段的过程，与遗传因素、环境因素有关，涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活。近年来大量研究表明，细胞内存在的非编码RNA 分子如miRNA、长链非编码RNA 及环状RNA 等，能够在转录水平、翻译水平调控靶基因的蛋白表达，影响正常细胞的分化、发育等生理过程，并参与肿瘤、自身免疫及感染等疾病的发生发展［12］。

表1 BC癌组织中miR-130a-3p、SPOCK1表达与患者临床病理参数的关系

miRNA 是真核生物细胞内的小RNA 分子，能够在转录后水平调控靶基因的表达。研究表明，肿瘤中存在miR-122、miR-221等多种miRNA异常表达的现象，如miR-221 表达升高能够直接抑制细胞周期素激酶抑制剂p57的表达，促进肿瘤细胞的G1期向S期转化，促进肿瘤细胞的恶性增殖［13］。miR-130 家族包括 miR-130a-3p、miR-130b-3p、miR-301a-3p 等，具有共同的编码基因序列。miR-130a-3p 作为miR-130家族成员，在乳腺癌、BC等肿瘤中存在异常表达下调的现象，可通过激活磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信号通路的活化，促进恶性肿瘤的发生和发展［5，14］。本研究中BC患者癌组织中miR-130a-3p的相对表达量降低，其机制可能与长链非编码RNA 的表达调控有关。有学者发现，肿瘤中长链非编码RNA HOTAIR可以作为分子海绵结合并抑制miR-130a-3p 的表达，进而导致下游缺氧诱导因子1A 表达上调，促进肿瘤的恶性进展［15］。此外，癌组织中miR-130a-3p的表达与肿瘤TNM 分期有关，高分期癌组织中miR-130a-3p 表达较低，表明miR-130a-3p 的低表达促进BC 的恶性进展。有学者报道，miR-130a-3p 能够诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，细胞表面间质性表型如N-钙黏素、Vimentin表达增加，导致肿瘤细胞易发生局部浸润，引起肿瘤分期升高［16］。

SPOCK1 又称为Testican-1，是一种细胞外基质的蛋白聚糖，属于钙离子结合蛋白多糖家族成员，其能够影响细胞的发育分化及增殖等生物学行为，参与细胞之间及细胞与基质之间的相互作用［17］。研究表明，SPOCK1 在非小细胞肺癌、肝癌等恶性肿瘤中异常表达升高，高表达SPOCK1 的肿瘤细胞增殖及迁移能力显著增强，并促进患者肿瘤的恶性进展［9，18］。本研究中，BC 癌组织中 SPOCK1 mRNA 的表达升高，可能与miRNA 对SPOCK1 的转录后表达调控有关。有研究发现，miR-139 能够直接结合SPOCK1 mRNA 的 3"非编码区，导致 SPOCK1 mRNA的稳定性降低，抑制SPOCK1 的表达，而肿瘤发生时miR-139 表达水平降低，导致 SPOCK1 表达升高［18］。BC 癌组织中 SPOCK1 mRNA 的表达与肿瘤 TNM 分期有关，提示SPOCK1 可能作为一种癌基因促进BC的发生发展。研究表明，SPOCK1 是细胞外基质重塑的关键调节因子，其能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，使肿瘤细胞容易与细胞外基质分离，肿瘤细胞获得较强的侵袭能力，导致肿瘤分期升高［19］。

本研究Pearson 相关分析结果显示，BC 癌组织中miR-130a-3p 与SPOCK1 mRNA 表达呈负相关。生物信息学预测结果表明，miR-130a-3p 与SPOCK1存在潜在的互补结合位点。miR-130a-3p 可能通过负向调控SPOCK1 mRNA 的表达，发挥抑癌的生物学功能。有学者在体外细胞实验中证实，miR-130a-3p 可直接结合到SPOCK1 mRNA 的3"非编码区，降低SPOCK1 mRNA 的稳定性，抑制SPOCK1 的表达，而肿瘤中miR-130a-3p 的表达降低则导致SPOCK1 表达增加，促进肿瘤细胞的增殖及迁移［20］。但BC中miR-130a-3p对SPOCK1表达调控的机制有待深入研究。

综上所述，BC 癌组织中miR-130a-3p表达下调，而 SPOCK1 表达上调。miR-130a-3p、SPOCK1 的表达与肿瘤TNM 分期有关，有可能作为新的BC 诊断及治疗的肿瘤标志物。但BC中miR-130a-3p是否直接通过影响SPOCK1 的转录水平的表达，进而影响BC的恶性进展，有待深入的实验研究。