细胞学标本BRAFV600E检测对常规穿刺活检难以定性诊断的甲状腺结节的应用价值

龚伟 黄渊 程枫 赵欢 陈国荣

随着高清B超检查应用的普及，甲状腺结节的诊断率越来越高。超声引导下的细针穿刺活检是甲状腺结节诊断中的重要一环。虽然该法准确性高、可重复进行且费用低廉，临床上已广泛应用[1]，但甲状腺结节的确诊仍然受到许多因素（比如结节的大小、性质、位置、获得的细胞学材料的数量以及涂片的质量等）的影响，有15%～30%诊断不能明确，这对临床医生作出是否手术的决定是一个巨大的挑战[2]。甲状腺乳头状癌是甲状腺最常见的恶性肿瘤，BRAFV600E突变是其特异性生物标志，在组织学检测上具有极高的阳性预测值（95.5%～100.0%）[3]，中国的甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变率为72.4%[4]，因此采用细胞学材料来检测BRAFV600E突变则具有十分重要的意义。本文旨在探讨当常规穿刺细胞学难以定性诊断甲状腺结节时，采用相应的细胞学标本检测BRAFV600E突变状态的应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年3月到2019年3月在丽水市中心医院同时进行甲状腺结节穿刺和甲状腺切除手术的患者795例，细胞学诊断根据甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统（TBS诊断报告系统）分类：1类为标本无法诊断或标本不满意，2类为良性，3类为意义不明确的细胞非典型病变或意义不明确的滤泡性病变，4类为滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤，5类为可疑恶性肿瘤，6类为恶性肿瘤。本研究共纳入经甲状腺TBS诊断为3、4、5类的患者135例作为研究对象，其中男27例，女 108 例，年龄 28～81（53.6±12.8）岁。本研究经丽水市中心医院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 方法 B超下定位，用无负压25G针以约3次/s的频率针吸甲状腺结节，每个可疑结节针吸3次，涂片后迅速固定于95%乙醇溶液中，用于HE染色，多余材料打入新柏液基保存瓶作薄层细胞病理学检查。将细胞学材料用干净的刀片刮下，对BRAFV600E的变异进行检测。为了明确在不能明确诊断细胞学（TBS 3、4、5类）中分子测试的临床意义，将细胞学中出现BRAF突变且术后证实为甲状腺乳头状癌者定义为真阳性；无BRAFV600E突变，术后也没有组织学恶性证据者定义为真阴性；有BRAFV600E突变，但术后证实为良性者定义为假阳性；细胞学材料中无BRAFV600E突变，但是组织学证实为恶性者则定义为假阴性。分别计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及准确率。其中3、4类恶性风险低于5类，且3、4类的处理与5类的不同，前者多为观察或诊断性切除，后者则多手术切除。因此将3、4类的62例患者归为组1，5类的73例患者为组2。在135例患者中75例为组织学证实的恶性肿瘤，其中70例为甲状腺乳头状癌，5例为滤泡癌。在这70例乳头状癌中，BRAF突变56例，3类2例，5类54例，分别分析BRAFV600E突变与B超各项特征的关系。

1.3 BRAFV600E的突变检测 采用荧光PCR（ARMS）法。首先将看过的细胞学涂片放置二甲苯浸泡5 min，脱去树脂及盖玻片，再分别经过二甲苯5 min，2道无水乙醇（各3 min），自然晾干后，将细胞学材料用干净的刀片刮下，进行消化过程，提取DNA。准备好试剂盒中的反应混合液和阳性质控品，上样DNA，离心或者轻甩8联PCR反应管，使得所加试剂聚集到反应管底部，并将反应管置入实时PCR仪器，进行3个阶段的扩增程序，在第3阶段60℃收集信号，执行实时PCR。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

组1和组2的细胞学标本BRAFV600E突变诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断准确率见表1。组1和组2的真阳性个数、真阴性个数、假阳性个数和假阴性个数见表2、3。B超特征BRAFV600E突变的关系分析见表4，其中BRAFV600E突变与结节回声质地、结节的大小均有关（均P＜0.05），与其余指标则均无关（均P＞0.05）。组1、组2与BRAFV600E突变的关系见表5。细胞学标本中BRAF野生型和突变型分别见图1、2。

表1 组1和组2的细胞学标本BRAFV600E突变诊断甲状腺癌的参数（%）

表2 组1 BRAFV600E突变的四格表参数（例）

表3 组2 BRAFV600E突变的四格表参数（例）

3 讨论

进入分子病理时代后，分子检测已成为肿瘤诊断、治疗和患者预后的重要辅助手段。目前已知BRAF基因是人类最重要的原癌基因之一。BRAFV600E的突变可导致RAF/丝裂原活化蛋白激酶信号通路的持续激活，从而引起肿瘤细胞的分化增殖、代谢和生长的改变，是甲状腺乳头状癌最常见的基因变异，而超声诊断恶性占所有甲状腺结节的7%～15%，其中甲状腺乳头状癌就占了85%～90%[5]。在临床实践中，单纯靠B超分流甲状腺结节患者已经无法满足临床医生的要求，因此在B超定位下的细针穿刺已成为评价甲状腺结节的重要手段。但是由于不可抗拒的因素，细胞学的3、4、5类的诊断是无法避免的，且3、4类的诊断恶性风险低，其中3类的恶性风险为6%～18%，5类的恶性风险为45%～60%[6]。

表4 70例乳头状癌患者一般资料及BRAF突变与B超影像学的关系[例（%）]

表5 组1和组2 BRAFV600E突变的关系（例）

本研究中，组1中检测BRAFV600E的灵敏度并不高，但是组1和组2具有100.0%的特异度和阳性预测值，这与相关文献的数据是符合的，因此在细胞学材料中加做BRAFV600E可以有效地帮助确诊乳头状癌，避免患者的手术延误[7]。在BRAF阴性的情况下，结合B超、PET-CT等检查手段则可以极大地减少不必要的手术。比较组1和组2中BRAFV600E突变的检测率具有统计学意义，进一步说明了5类细胞学诊断发生恶性风险高于3类诊断。

甲状腺癌中BRAFV600E的突变流行率取决于以下几个因素：地理环境、种族和碘的摄入，其中亚洲人群BRAFV600E的突变率最高（84.5%），西方人群最低（30%～50%）[8]。BRAFV600E的突变与甲状腺乳头状癌的亚型相关，80%～100%的高柱状亚型乳头状癌（罕见）、45%～68%的经典型乳头状癌（常见）和高达12%～18%的滤泡亚型乳头状癌中出现BRAFV600E突变[9]。而在中国，大多数的甲状腺癌为经典型乳头状癌，因此大多数的情况下，穿刺细胞学难以定性诊断的患者多涉及到甲状腺乳头状癌与良性病变的鉴别诊断。细胞学标本上进行BRAFV300E检测的诊断价值随地理环境和种族的不同而产生变化。在西方，该诊断的灵敏度下降到40%，尽管理论上特异度和阳性预测值仍然不变。而在亚洲人群中，甲状腺乳头状癌BRAFV300E突变率高，这使在细胞学标本上进行BRAFV300E的检测具有更加重要的意义。

图1 细胞学标本BRAFV600E野生型

图2 细胞学标本BRAFV600E突变型

本研究在B超特征与BRAFV600E突变的关系中，结果显示除了回声质地和结节大小外，其他参数与BRAFV600E的关系不大。有相关文献报道，认为BRAFV600E的突变与B超特征无关[10-11]，但是也有文献指出BRAFV600E的突变与常见的可疑B超特征是相关的，它包括纵横比失调、边界不清、低回声、微钙化和空晕的缺失,当≥3个可疑B超特征同时出现时，BRAFV600E的阳性预测值可达82%[12]。不管怎样，由于本研究样本量偏小，且只局限于分析不能明确诊断的结节中BRAFV600E突变，故B超特征与BRAFV600E的关系需要更进一步的广泛研究来证实。

综上所述，对于常规穿刺细胞学难以明确性质的甲状腺结节，采用细胞学标本的BRAFV600E检测对于外科医生作出相应的临床处理具有重要的意义，可减少延误手术的机会，可在具有分子病理实验室的医院推广使用。