荧光原位杂交与染色体核型技术在儿童急性淋巴细胞性白血病诊断中的临床应用

车琳，赵文理

[1苏州大学附属儿童医院，江苏 苏州；2上海交通大学附属第六人民医院南院（原苏州大学附属儿童医院），上海]

0 引言

急性淋巴细胞性白血病（acute lymphocytic leukemia,ALL）为儿童中发生率较高的恶性肿瘤。在初诊过程中进行染色体或基因异常的检测有助于更好地指导临床治疗，促进预后。当前荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）与染色体核型技术在这一检测中得到了应用。本研究就这一技术在ALL诊断中的应用进行了分析。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选择研究区间为2011年11月至2013年12月，入选研究样本为132例本院初步诊断为ALL的患儿，对患儿均实施了血常规五分类、骨髓穿刺涂片或活检、细胞遗传学等检测方法，患儿病情均符合血液学关于ALL的诊断标准，被确诊[1]。

1.2 研究方法

1.2.1 荧光原位杂交

1.2.1.1 仪器

水浴箱，荧光显微镜，杂交仪，震荡仪，离心机。

1.2.1.2 试剂

乙醇（浓度为70%、85%、100%），2*SSC、0.4*SSC（saline sodium citrate），DAPI（4-6-diamidino-2phenylindole）II溶液。

1.2.1.3 探针

包括4、10、17号染色体、CBFβ、AML1/ETO、PML/RARα、BCR/ABL、5q-、11q23等。

1.2.1.4 操作程序

（1）玻片准备：在玻片上滴上获取的标本，通过荧光显微镜进行滴片质量的观察，对杂交区域做好标记，标本质量理想状态为细胞均匀分布，密度适宜，无重叠现象，胞浆含量少。然后将以上玻片置于37℃水浴预温的2*SSC溶液中，进行30min的老化处理，之后使用各个不同浓度的乙醇于室温条件下进行阶梯脱水处理，时间为2-3 min，室温下晾干；（2）探针准备：5μl缓冲液及1μl探针加入0.5ml离心管中混匀，离心1-3s；（3）杂交：①在玻片划定的杂交区域加10μl探针混合液，使用盖玻片（规格为18×18mm）将其盖好后使用封片胶进行封片，置入杂交仪，②杂交仪设置：72℃-75℃的变性温度，2-5 min，37℃的杂交温度，16-18h；（4）洗涤（快洗）：72℃的0.4*SCC缸内温度，2 min，2*SSC室温2 min，100%乙醇2 min；（5）复染：各杂交区域均加10μl DAPI II溶液，盖玻片封片后室温杂染15 min；（6）镜检：每张片随机分析计数200-1000个间期核，进行相应杂交信号的记录。阳性界定值下限设为0.5%-5%。

1.2.2 细胞遗传学分析

对骨髓采取直接法或是24h培养法进行染色体的制备，R显带或G显带技术分析核型，根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》描述染色体异常[2]。

1.2.2.1 短期培养法

（1）骨髓液6-8ml注入含1640培养基的培养瓶中，在超净台上从培养瓶抽取少许骨髓标本并滴于载玻片上，用Hb吸管吸20μl于0.38ml 2%白细胞稀释液（2%HAC）中，将其充分混匀，镜下进行有核细胞计数，将培养基置于37℃培养箱进行24h的培养；（2）加80μl秋水酰胺后继续置入37℃培养箱培养1h；（3）放入到10ml离心管中，转速为每分钟1000r，离心10min，与此同时将低渗液在37℃条件下进行预热）；（4）将上清液去除，将低渗液加入其中配置成8ml，充分进行混匀，放入37℃水浴箱，时间为35 min；（5）将其从水浴箱取出，加固定液1-2ml，将其配制为9-10ml，打匀后马上进行离心处理，每分钟1000r的转速下离心10 min；（6）将上清液去除，加入固定液配成10ml，混匀后放在室温下30min，然后以1000r/min离心10min，此步骤再重复进行2遍；（7）去除上清液，加1-2ml固定液，混匀加盖在4℃下保存。

1.2.2.2 直接法

（1）骨髓液6-8ml注入含1640培养基的培养瓶，在清洁瓶中注入标本，使用生理盐水加至瓶子2/3的位置，然后加300μl秋水酰胺，37℃下进行1h培养或4℃环境下进行3-4h培养；（2）转到2个离心管中，1000r/min进行10min处理，期间低渗液在37℃条件下进行预热；（3）弃上清，加8ml低渗液，放入37℃水浴箱处理40min；之后按照24h培养法进行处理。

1.2.2.3 R显带

适用于骨髓标本：（1）打匀骨髓细胞悬液，制作4-6张滴片，在洁净滤纸上平铺开，待干；（2）取白瓷立式染缸（容积50ml）2-3只，倒入pH6.5的Earle’s溶液，加盖后放进水浴箱将其加热到87.5℃；（3）玻片标本表面干燥后，置于预温87.5℃的Earle’s溶液中温育（时间1-2h），注意玻片之间留一点间隔；（4）温育1h，之后间隔5-10min将其中的1-2片拿出来，流水冲洗；（5）用10%Giemsa染色液处理8-10min，然后水洗，待干，镜检。观察最初取出的标本上染色体显带，以此帮助判断显带合适需要的时间。

1.2.2.4 G显带

适用于外周血标本：（1）标本老化或烤片：将滴有标本的滴片放在37℃温箱中放置7d，也可以放在80℃烤箱中进行2-4h的烘烤，让其自行冷却；（2）将生理盐水配置的0.1%胰酶溶液和0.02%乙二胺四乙酸钠按1:1比例混合，然后用10%NaHCO3或3%Tris溶液调为6.8-7.0的pH值，37℃水浴；（3）玻片置于以上溶液，轻轻振荡30-60s或更长时间；（4）胰酶处理完毕后马上取出片子，在PBS溶液中进行2次一过性漂洗；（5）用5%Giemsa染色液处理5-10min；（6）自来水冲洗，待干，镜检。

1.3 统计分析

组间（%）的比较实施卡方检验，以α=0.05为检验水准，P＜0.05代表有统计学差异。

2 结果

ALL患儿共132例，男67例，女65例，男女性别比为1.03∶1，最小1岁，最大16岁，平均5岁，B-ALL、T-ALL分别有126例、4例，另有1例B+髓系混合细胞白血病，1例免疫分型不明确。

患儿遗传结果见表1，显带方法检出异常核型45例（34.1%），其中共10种单纯数量异常，共计20例（超二倍体12例，亚三倍体4例，超单倍体1例，四倍体1例，1例47，XY，+X[9]/46，XY[4]，1例全片仅3个分裂相，有单纯结构异常13种（15例），其中t（1；19）3例，add(X)(q27)Y,del(7)(p13),i(21)(q10)1例，t（9；22）5例，t（9；11）、t（4；11）、t（12；17）、t（2；13）各1例，1q+，6q-（q23）1例，del（2）（p12），t（9；22）（q34；q11）1例，同时有2种异常的共10例，其中t（9；11）（p22；q23），+20，+22[5]1例，4p-，-12,12p+,21q+ 1例，超二倍体4例，其中合并1q+、12p+的分别有3例、1例，另有4例亚三倍体。FISH结果中，阴性47例，异常85例（64.4%），其中结构异常共34例，23例TEL/AML1，BCR/ABL、MLL重排各有6例，数量异常57例，数量、结构混合异常的共有6例，两种方法下有65例结果一致，其中正常核型、亚三倍体、超二倍体、超单倍体、BCR/ABL、MLL重排分别有31例、8例、16例、1例、6例、3例。对表2结果实施χ2检验，结果为χ2=24.2，P＜0.05，提示FISH在ALL患儿遗传异常的检测中比显带技术更优。

表1 ALL患儿两种方法主要异常检出结果（n）

表2 显带及FISH在ALL患儿遗传异常检测中的应用（n）

表3示，FISH检出正常核型中有28例异常，数目异常、TEL/AML1、MLL重排分别为14例、13例、1例。未见分裂相的28例中，FISH检出7例阴性，有21例检出异常，其中数量异常10例，TEL/AML1有9例，MLL重排共2例。传统检测方法异常、FISH正常的患者共有9例，χ2检验后得χ2=5.86，P＜0.05，研究提示，染色体显带失败可以使用FISH方法，有利于提升异常检出率。

表3 FISH在染色体分析失败及核型正常患儿中的应用（n）

3 讨论

ALL为发生率较高的儿童恶性肿瘤疾病，初诊若能检出染色体或基因异常，会更好地指导治疗，促进预后。传统检查方法对ALL遗传异常的检出率有待提升，约25%无法检出，无论是成人还是儿童ALL预后风险因素判断中，FISH均扮演重要角色[3]，因此有必要进行不同方法的联合检测。

由于FISH检验不受细胞分裂周期影响，有较高的分辨率，因此对ALL各种异常均有较高的灵敏度，比显带技术的检测效果更优，能够更好地检出显带技术未检出的异常[4]。此外，FISH对于染色体内部改变的鉴别敏感性不如细胞遗传学方法，并受到探针种类的限制。

3.1 超二倍体、亚三倍体及亚二倍体

本研究中，显带技术检出8例亚三倍体，超二倍体16例，占ALL患儿的12.1%，亚二倍体没有检出。以上检出的亚三倍体、超二倍体都是B-ALL，其中有3例（18.8%）超二倍体存在结构异常，均为1q+，经FISH检测，24例患儿均为阳性。受到条件限制，我们只能对部分染色体数目异常进行检测（包括4号、9号、10号、11号、12号、17号、21号、22号及性染色），有17例增加3条以上染色体，但是不能确定类型。

3.2 TEL/AML1

即ETV6/RUNX1，具有遗传学隐秘性，即对常规染色体显带隐秘，在儿童ALL中约25%的ETV6 (TEL) 和RUNX1 (AML1)隐匿异位未被发现直到FISH技术出现[5]。通过FISH技术，本研究检出17.4%（23/132）TEL/AML1基因，均为B-ALL，比北京儿童医院、SJCRH-15研究，荷兰Emma医院等的研究结果略低，比DCOG-9研究结果略高[6-8]，检出+21*2的有1例，其余没有检出21号染色体内部扩增等其他异常。全部患儿中，22例＜10岁，15例3-5岁，平均5岁，与相关研究一致。

3.3 MLL重排

MLL基因位于11q23，多数11q23异常可通过核型显带法检出，但对于一些隐匿异位、尚未确认的重排形式、较稀少的异位染色体无法检测，如t（11；19）、t（6；11），通过FISH可以作为补充检测手段，提升检出率[1,9]。本研究通过显带技术检出3例MLL重排，检出率2.3%，2例t（9；11），1例t（4；11）。FISH检出4.5%（6/132）不能确定类型的MLL重排，和北京儿童医院（2.4%）、英国儿童（2%）、荷兰Emma医院（6.8%）略有差异[6,8]。还检出1例核型正常B-ALL，显带无分裂相的2例为B-ALL，1例FISH结果同时合并TEL/AML1。

3.4 BCR/ABL

Ph+ALL病例有高于95%的病例能够通过显带技术检出，其具有潜在隐匿性，因此有必要联合FISH共同检测[1,6]，用FISH方法还能够定量监测BCR/ABL基因，进行微小残留病（minimal residual disease,MRD）鉴定，进行疗效判断以及预后效果评估。本研究两种检测方法均检出6例BCR/ABL阳性病例，均为B-ALL，占总人数的4.5%，报道结果与一些研究一致，比北京儿童医院的5.4%略低，高于英国儿童，但比其他一些亚洲国家水平低[9-11]，其中1例染色体存在del（2）（p12），FISH未检出，相比于显带技术，FISH对染色体内部结构异常的敏感度略低，因此，推荐两种方法同时进行染色体异常检测。

3.5 E2A/PBX1

即TCF3/PBX1，文献报道，FISH方法对于该基因的检测效果可靠性很高[1]。本研究中，染色体核型筛查出2.3%（3/132）的t（1；19）阳性B-ALL，比其他人群发病率低[8,12]，其中3岁1例，4岁1例，10岁1例，年龄层偏小，由于没有相应的，导致本研究中这种类型的融合基因没能实施FISH检测。

综上所述，在儿童急性淋巴细胞性白血病总体研究中，FISH异常检出效果较好。数量异常最常见的类型为超二倍体，TEL/AML1是最常见结构异常，该研究与国内外其他研究结果具有一致性[5,12,13]。FISH在ALL中对染色体数量、结构异常、异位检测均有很高的灵敏度，显著优于传统技术。受到ALL染色体不易分散，标本质量要求高的限制，因此对检测结果有一定的影响，而对于染色体显带失败或结果正常的情况，可以再此进行FISH检测，以此提高检出率[14-16]。