基于多基因的分子分类技术在库蠓鉴定中的应用

杨美琼， 张建庆， 蔡怡珊， 王飞鹏， 黄恩炯

(1.福州国际旅行卫生保健中心，福建 福州350001；2.福建农林大学植物保护学院，福建 福州350002)

库蠓属(Culicoides)属节肢动物门(Arthropoda)昆虫纲(Insecta)双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)，是蠓科中最大的一个属，也是分布最广、种类最多、与人畜关系最密切的一类吸血蠓，还是多种人兽共患病的传播媒介[1-2].库蠓的种类鉴定是动植物检疫和疾病预防控制的核心环节.

目前，蠓类的鉴定仍主要依赖于传统形态学方法.但库蠓不仅体型微小、鉴别特征少，而且具有表型可塑性和遗传可变性，同时鉴定常受虫态、性别和标本完整性的影响，所以容易出现误判[3].为弥补传统形态学鉴定的不足，亟需寻找一种快速准确的鉴定技术.

近年来，随着以PCR 为基础的DNA 序列测定方法的建立和广泛使用，以DNA 条形码技术为主的分子分类技术在昆虫的鉴定中发挥了重要作用，极大地弥补了传统形态学鉴定的不足.线粒体COⅠ、COⅡ和核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区ITS 等基因也在蠓类的分子鉴定中得到应用，澄清了蠓类一些近缘种和复合组的分类问题[4].然而，其主要以单基因检测为主，仍难以实现对近缘种和复合组的准确鉴定.

本研究选择COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和ITS 等多基因对采自我国14 个省(自治区)的77 种库蠓进行分子鉴定，以期为库蠓的准确鉴定提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验标本 库蠓采自我国福建、海南、广西、黑龙江、河北、安徽、湖南、新疆、青海、甘肃、四川、云南、西藏及台湾等14 个省(自治区)的36 个采样点，共77 种284 份标本.将每份标本拍照并编号后用于试验.所有标本均保存于军事科学院军事医学研究院医学昆虫标本馆.

1.1.2 主要试剂 昆虫基因组DNA 提取试剂盒(Insect gDNA Minipre Kit)购自Biomiga 公司，凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)购自OMEGA 公司，引物由Invitrogen 公司合成，克隆试剂盒(pMD 18-T Vector Cloning Kit)购自TaKaRa 公司.

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采用灯诱法和牛帐诱法[5]采集库蠓.采获的库蠓经麻醉后保存于95%乙醇中.

1.2.2 标本制作和形态鉴定 参照文献[5]进行标本制作和形态鉴定.鉴定结果由军事科学院军事医学研究院虞以新研究员复核确认.

1.2.3 基因组DNA 提取 取库蠓翅基部约1 mm3的组织，研碎，按照DNA 提取试剂盒说明书提取基因组DNA，-20 ℃保存备用.

1.2.4 PCR 扩增 选用COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和ITS 基因进行PCR 扩增，引物序列及相关信息见表1.除用于切胶回收的PCR 反应体系为50 μL 外，其余均为25 μL 扩增体系.PCR 扩增体系(25 μL):DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×缓冲液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq 酶1.25 μL，ddH2O 18.75 μL.反应条件:94 ℃预变性3 min，94 ℃45 s，40～48 ℃45 s，72 ℃60 s，35 个循环，72 ℃延伸10 min.

表1 引物信息Table 1 Information on the PCR primers

1.2.5 PCR 产物纯化、克隆及测序 PCR 产物经凝胶电泳检测后，用凝胶回收试剂盒进行纯化，需要克隆的样品使用克隆试剂盒进行DNA 克隆，阳性克隆菌液用60%甘油保存.直接测序的产物，所用引物与PCR扩增所用引物相同；克隆的样品，采用相应载体的通用引物作为测序引物.为确保所获基因序列的准确性，所有产物均送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序.

1.2.6 序列分析 利用DNAMAN、BioEdit、Clustal W、MEGA 5.2、MrBayes 等生物信息学软件对库蠓基因序列进行分析；同时，应用MEGA 5.2 计算库蠓种间与种内各基因基于Kimura 双参数模型的遗传距离，并以与库蠓属亲缘关系最近的细蠓属中的北域细蠓(Leptoconops borealis)[9-10]作为外群，通过贝叶斯推理法(Bayesian inference， BI)构建系统发育树.

2 结果与分析

2.1 各基因的遗传距离

2.1.1 COⅠ 93.48%库蠓的种间遗传距离为0.15～0.30，平均距离为0.22(图1A).其中，安酋库蠓(C.andrewsi)与印度库蠓(C.indianus)、美丽库蠓(C.bellulus)与长喙库蠓(C.longirostris)、大和库蠓(C.japonicus)与泊地库蠓(C.toyamaruae)、马来库蠓(C.malayae)与类牛库蠓(C.parabubalus)之间的遗传距离最小，仅为0.002，而琉球库蠓(C.actoni)与新竹库蠓(C.liui)之间的遗传距离最大(0.37).65.85%库蠓的种内遗传距离小于0.02，平均距离为0.03(图1B).其中，美丽库蠓、长喙库蠓、怒江库蠓(C.nujiangensis)、异域库蠓(C.peregrinus)、边缘库蠓(C.pictimargo)、色茎库蠓(C.pictipennis)等6 个库蠓的种内遗传距离为0，褐肩库蠓(C.parahumeralis)的种内遗传距离最大(0.17).

图1 库蠓COⅠ基因序列K2P 遗传距离频度分布Fig.1 Frequency distribution of K2P distance of the COⅠgenes from Culicoides species

2.1.2 Cyt b 94.13%库蠓的种间遗传距离为0.15～0.30，平均距离为0.23(图2A).其中，大和库蠓与泊地库蠓、马来库蠓与类牛库蠓之间的遗传距离最小(0.002)，类牛库蠓与褐肩库蠓之间的遗传距离最大(0.35).69.44%库蠓的种内遗传距离小于0.02，平均距离为0.04(图2B).其中，安酋库蠓、美丽库蠓、沙库蠓(C.desertorum)、赫氏库蠓(C.hegneri)、屏东库蠓(C.hui)、金娜库蠓(C.kinari)、边缘库蠓、细须库蠓(C.tenuipalpis)等8 种库蠓的种内遗传距离为0，霍飞库蠓(C.huffi)的种内遗传距离最大(0.19).

图2 库蠓Cyt b 基因序列K2P 遗传距离频度分布Fig.2 Frequency distribution of K2P distance of the Cyt b genes from Culicoides species

2.1.3 16S rDNA 96.15%库蠓的种间遗传距离为0.10～0.25，平均距离为0.16(图3A).其中，大和库蠓与泊地库蠓之间的遗传距离最小(0)，类牛库蠓与李拭库蠓(C.riethi)之间的遗传距离最大(0.27).72.09%库蠓的种内遗传距离小于0.02，平均距离为0.02(图3B).其中，美丽库蠓、沙库蠓、屏东库蠓、赫氏库蠓、大和库蠓、金娜库蠓、马来库蠓、迷你库蠓(C.minimus)、异域库蠓、泊地库蠓等10 个蠓的种内遗传距离为0，细须库蠓的种内遗传距离最大(0.09).

2.1.4 ITS 89.92%库蠓的种间遗传距离为0.15～0.30，平均距离为0.21(图4A).其中，蓝腹库蠓(C.cyancus)与华蓥库蠓(C.huayingensis)之间的遗传距离最小(0.003)，克彭库蠓(C.kepongensis)与异域库蠓之间的遗传距离最大(0.39).97.22%库蠓的种内遗传距离在0.14 以内，平均距离为0.04(图4B).其中，盔状库蠓(C.cassideus)的种内遗传距离为0.003，短须库蠓(C.brevipalpis)的种内遗传距离最大(0.17).

2.2 系统发育分析

为确保系统发育分析结果的准确性，对各个数据集的系统发育信号进行评估.结果表明，各数据集的碱基替换均未饱和，可用于系统发育树的分析.

本研究获得线粒体COⅠ+16S rDNA+Cyt b 联合基因158 条(片段长度为1 530 bp)和COⅠ+16S rDNA+Cyt b+ITS 完全联合基因118 条(片段长度为2 787 bp)，隶属于屋室亚属(subgenusOecactaPoey)、带纹亚属(subgenusBeltranmyiaVargas)、库蠓亚属(subgenusCulicoidesLatreille)、二囊亚属(subgenusAvaritiaFox)、血色亚属(subgenusHaemophoructusMacfie)、三囊亚属(subgenusTrithecoidesWirth et Hubert)和单囊亚属(subgenusMonoculicoidesKhalaf).

图3 库蠓16S rDNA 基因序列K2P 遗传距离频度分布Fig.3 Frequency distribution of K2P distance of the 16S rDNA genes from Culicoides species

图4 库蠓ITS 基因序列K2P 遗传距离频度分布Fig.4 Frequency distribution of K2P distance of the ITS genes from Culicoides species

根据AIC(Akaike information criterion)原则选择最佳核苷酸替换模型进行系统发育分析，各单基因及联合基因的最适模型都为GTR+I+G.从线粒体基因联合数据集的系统发育树(图5)可知，不同亚属之间构成了13 个平行支系.其中以二囊亚属为最大的支系，主要包含琉球库蠓、迷你库蠓组成的琉球库蠓组(actoni group)以及东方库蠓(C.orientalis)、牧场库蠓(C.pastus)、暗色库蠓(C.fulvus)、连斑库蠓(C.jacobsoni)、美丽库蠓、长喙库蠓、黑斑库蠓(C.migromaculatus)、怒江库蠓等组成的东方库蠓组(orientalis group)；琉球库蠓组与东方库蠓组构成姐妹群，并有较高的支持率(PP 值为0.73).此外，在另外一个较大的支系上，屋室亚属与带纹亚属构成姐妹群(PP 值为0.51).

基于完全联合数据集的系统发育树(图6)分为2 个支系:其中一个小支系仅包含麦氏库蠓(C.mcdonaldi)和刺螫库蠓(C.punctatus)两种；另一个支系拓扑结构基本同于线粒体基因联合数据集，不同的是牧场库蠓未与东方库蠓组的其他蠓种聚在一起，而是与尖喙库蠓(C.oxystoma)聚在一支.

在不同数据集的系统发育树中，仅单囊亚属是单系群，其余亚属均不具有单系性.

3 讨论与结论

本研究以近6 年来在我国14 个省(自治区)采获的库蠓标本为研究对象，初步建立了基于线粒体COⅠ、Cyt b、16S rDNA 和核糖体ITS 多基因的库蠓分子分类体系.该体系与形态学鉴定结果基本吻合，并从中发现了库蠓属7 个新种，9 个我国新记录种(待发表).

种间与种内的遗传距离分析结果显示，基于各基因序列K2P 校正的种间与种内平均遗传距离不同，以16S rDNA 的种间(0.16) 和种内(0.02) 的平均遗传距离最小，COⅠ(种间0.22、种内0.03)和ITS(种间0.21、种内0.04)的平均遗传距离次之，而Cyt b 的种间(0.23)和种内(0.04)的平均遗传距离最大.在不同的基因标记中，分布范围较广的蠓种的种内遗传距离常较大，如褐肩库蠓基于COⅠ的种内遗传距离达0.17；而分布范围较窄的蠓种的种内遗传距离较小，如美丽库蠓基于COⅠ、Cyt b 以及16S rDNA 的种内遗传距离都为0.这提示大的种内变异可能产生于地理隔离的不同族群[11]或存在隐存种[12].一些形态近似的库蠓的种间遗传距离较小，如安酋库蠓与印度库蠓、美丽库蠓与长喙库蠓、马来库蠓与类牛库蠓、大和库蠓与泊地库蠓、蓝腹库蠓与华蓥库蠓，基于不同基因的遗传距离仅为0～0.003.

图5 基于COⅠ+Cyt b+16S rDNA 联合基因的BI 系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on COⅠ+Cyt b+16S rDNA by Bayesian inference

系统发育树表明，仅单囊亚属是单系群，屋室亚属、带纹亚属、库蠓亚属、二囊亚属、血色亚属、三囊亚属都形成并系群，这与早先的研究结果[12]一致.

图6 基于COⅠ+Cyt b+16S rDNA+ITS 联合基因的BI 系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on COⅠ+Cyt b+16S rDNA+ITS by Bayesian inference

不同基因数据集的聚类结果提示:(1)安酋库蠓(同龙溪库蠓C.lungchiensis)、印度库蠓、异域库蠓可能为同种异名.龙溪库蠓与安酋库蠓没有明显区别，因后者发表在先，故统一更名为安酋库蠓；安酋库蠓与印度库蠓也非常近似[13-14]，且两者间基于COⅠ的遗传距离仅为0.002，明显低于学者基于DNA 条形码对种间遗传距离大于2%的界定[15]；Borkent et al[16]将龙溪库蠓(安酋库蠓)作为异域库蠓的同种异名，这与本研究中安酋库蠓与异域库蠓形成姐妹群的结果相一致.(2)马来库蠓、类牛库蠓、南山库蠓(C.lansangensis)、苏岛库蠓(C.sumatrae)可能为一个种团.在不同基因的系统发育树上，马来库蠓与类牛库蠓都为姐妹群，且两种间遗传距离小(COⅠ和16S rDNA 均为0.002)；从形态上看，这两种蠓的鉴定特征基本相似，用于辨别的主要特征仅为前者的受精囊一大一小[17]，后者的两个受精囊基本等大[18].系统发育树上，南山库蠓、苏岛库蠓与马来库蠓、类牛库蠓聚于同一支且有高的支持率，PP 值均为1.00；形态上，这4 种库蠓的翅斑也较为近似.(3)美丽库蠓与长喙库蠓可能是种内的形态变异体或同种多态型.美丽库蠓翅面径脉端部2个明斑明显呈不同程度的倾斜，而长喙库蠓的明斑偏直，且前者的翅面明斑明显小于后者；美丽库蠓雄虫的尾器第9 背板不呈弧形凹陷，而长喙库蠓有宽而深的凹陷；前者雌虫的2 个受精囊不等大，而后者雌虫的2 个受精囊基本等大.但两者在系统发育树上为姐妹群，且基于不同基因数据集的遗传距离均很小(COⅠ为0.002，16S rDNA 为0.001，Cyt b 和ITS 均为0.008).(4)泊地库蠓可能是大和库蠓的近缘种.系统发育树显示，泊地库蠓与大和库蠓是单系群，且PP 值为1.00，这与两者间较小的遗传距离(COⅠ和Cyt b均为0.002，16S rDNA 和ITS 均为0)相符.但两者在形态上有明显区别:大和库蠓翅面中肘叉和纵二室有明斑，而泊地库蠓通常没有，且前者的翅面明斑大于后者；前者雌虫的受精囊呈卵形，而后者呈圆形.(5)注意迷你库蠓与琉球库蠓的准确鉴别.两者都属于小型蠓种(体长约为1 mm)，是琉球库蠓组里仅有的2 个种.形态上除受精囊大小外并无明显区别，琉球库蠓的两个受精囊近乎等大，而迷你库蠓的两个受精囊大小不一；基于COⅠ基因的系统发育树显示，两者形成姐妹群.因此，单靠形态学可能会造成错误的鉴定.

利用线粒体COⅠ、16S rDNA、Cyt b 和核糖体ITS 基因不仅能准确鉴定蠓种，还能澄清库蠓属里的同种异名问题.但本研究仍有一些方面待改进:部分标本因形态不完整而无法鉴定到具体种，或因保存方式不当而未能提取出核酸；同时，所有试验标本均为单只处理，且仅有胸段翅基部组织用于核酸提取，提取的总DNA 浓度低、体积小，导致部分标本的某些基因片段扩增失败，造成数据不全；再者，吉林亚属(subgenusJilinocoides)、桥茎亚属(subgenusPontoculicoides)等个别亚属种类数太少，分布地点较为局限，本研究未能采获这些亚属的标本.因此，今后有待补充标本并做进一步研究.