宁夏地区不育患者染色体多态性与人工辅助生殖技术助孕结局的关系*

刘芳, 包俊华, 于辛酉, 金锐, 唐大伟, 白刚, 马文叶, 任萌萌

1银川市妇幼保健院生殖医学中心(宁夏银川 750001)； 2宁夏医科大学总医院医学实验中心(宁夏银川 750001)

染色体多态性的定义是染色体异染色质区结构内的微小变异。异染色质由高度重复的非编码DNA序列所连接构成，而染色体多态性在近些年以来，随着医学科技以及生物基因工程等学科的飞速发展，已经成为医学科学所集中探讨的焦点问题之一[1-3]。目前全球所研究的染色体多态性变化较多，如1号、9号、16号染色体的次缢痕区加长或者缺如，9号染色体臂间倒位，D/G组染色体短臂或者Y染色体长臂的长度出现变异等[4-6]。长久以来，研究人员一般认为异染色质的变异不会产生实际的临床意义，所以将其归属为染色体的正常多态性变化。但是随着近些年以来我国人群中不孕不育患者数量和比例的急速上升，部分学者提出异染色质区的变异可能会引发部分客观存在的临床改变，比如原发性不孕不育以及反复流产等[7-8]。同时，由于不孕不育家庭的数量上升，采用人工辅助生殖技术(ART)完成生育功能的需求也在逐年上升[9-10]。而接受ART的男性患者是否会因为染色体多态性的问题导致多次助孕失败，尚存在不小的争议。而人群中基因的分布情况又与地域差异密切相关，因此针对本地区人群的染色体多态性调查就显得较为重要。本研究选择我中心接诊的1 029例男性患者的资料进行回顾性分析，对宁夏地区不育男性患者染色体多态性与ART助孕[体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)]结局的关系进行探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月至2018年10月在我中心首次接受IVF/ICSI-ET治疗的1 029例男性患者为研究对象。

纳入标准：(1)男女双方为合法夫妻，生殖系统均不存在解剖结构异常；(2)女方的染色体核型为46，XX，且不具有任何染色体多态，年龄低于38周岁；(3)男方的染色体核型为46，XY，可以携带或不携带染色体多态；(4)均为新鲜周期移植样本，关于本次研究的数据完整，可以分析。

排除标准：(1)男女双方患有已知可以对ART结局产生影响的疾病；(2)具有对IVF/ICSI-ET过程中使用药物的过敏现象；(3)男方具有明确的染色体异常，无精症等；(4)相关数据不完整。

按照所采用的助孕方法和男方是否具有染色体多态，分为A组(接受IVF且男方染色体多态，n=87)、B组(接受IVF且男方染色体正常，n=530)、C组(接受ICSI且男方染色体多态，n=61)、D组(接受ICSI且男方染色体正常，n=351)。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析 采集患者的肘部静脉血1 mL，放入肝素抗凝管中，取0.5 mL接种在5 mL RPMI 1645培养基中，以37℃恒温培养72 h。之后进行常规染色体制片和G显带。对样品计数分裂相中期细胞共30个，嵌合型需计数50个，G带核型在镜下完成分析3～5个。依据人类细胞学国际命名体质(ISCN)完成染色体的核型分析诊断。

1.2.2 控制性超排卵 我中心执行常规超排卵方案，具体如下：在女性的黄体中期进行降调节，达到降调标准后，依据患者的年龄、体重、基础卵泡刺激素水平、窦卵泡数量等，制定促性腺激素的起始剂量。在周期启动之后，对女性的血清激素水平和卵泡发育情况进行动态监测，根据个人的情况适时调整促性腺激素的用量。在有1个卵泡直径>2 cm或者2个卵泡的直径>1.8 cm的情况下，停止使用促性腺激素。当天注射人绒毛膜促性腺激素。完成注射之后的36 h后取卵。所取得的卵子经过体外受精收培养72 h。之后进行胚胎移植或者继续进行囊胚培养后移植。

1.2.3 妊娠结局 在胚胎移植之后的14 d和18 d，抽取女性的外周静脉血，分析血清中β-HCG的含量，若结果为阳性而且移植完成35 d后盆腔B超显示出现孕囊，则表示临床妊娠。如患者在妊娠12周内出现终止则为早期流产[11]。

1.3 观察指标 分别对比A组与B组，C组与D组的一般临床资料。包括女方的年龄、女方的体质指数(BMI)、促性腺激素用量、移植当天子宫内膜厚度、获卵数量、移植胚胎数量、移植囊胚比例。描述全部男性染色体多态的核型分布情况。A组与B组的妊娠结局对比。C组与D组的妊娠结局对比。其中各类妊娠结局的定义依据参考文献[12]中的定义。

2 结果

2.1 A组与B组、C组与D组的一般临床资料对比 A组与B组、C组与D组的各项一般临床资料对比中，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

表1 A组与B组的一般临床资料对比

表2 C组与D组的一般临床资料对比

2.2 全部男性染色体多态的核型分布情况 在148例出现染色体多态的男性患者中，染色体臂间倒位28例，占18.92%，常染色体次缢痕区加长27例，占18.24%，D/G组染色体短臂44例，占29.73%，Y染色体长臂长度变异49例，占33.11%。见表3。

2.3 A组与B组的妊娠结局对比 A组与B组的正常受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、早期流产率的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.4 C组与D组的妊娠结局对比 C组与D组的正常受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、早期流产率的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表3 全部男性染色体多态的核型分布情况

表4 A组与B组的妊娠结局对比 例(%)

表5 C组与D组的妊娠结局对比 例(%)

3 讨论

染色体的多态性是近些年以来全球范围内研究的一个热点问题，其主要表现为异染色体在一定程度上的变异，尤其是具有高度重复DNA的结构异染色质的变异。出现结构异常的染色质主要集中在端粒、着丝粒、随体、次缢痕以及Y染色体的长臂端。关于染色体多态性与若干疾病的研究，近些年在基因科学的飞速进步下，也取得了较大的突破，但是染色体的多态性和人体生殖功能之间的关系，则一直存在不小的争议。部分学者认为染色体多态性和多种生殖异常，如流产、胎停育、死胎、男性不育、精子异常等具有关联，可以导致出现不同类别的临床表现[12-14]。染色体的次缢痕与随体部分的变异有可能致使纺锤体无法与染色体连接，对染色体的正常分离与运动产生严重干扰。而异染色质在着丝粒的功能方面具有十分重要的功效，是姐妹染色单体在结合以及分离过程中所必须的基础之一。可以认为染色质在维持基因组的稳定，进化以及细胞正常分化的基因调控表达方面，具有核心功能。所以认为染色质的异常有可能对胚胎的发育构成影响。以此理论为基础，则推论出在接受人工辅助生殖的患者中，进行一定的染色体情况筛查是十分必要的。如果检查结果显示，夫妻任意一方出现染色体的异常(包括常染色体和性染色体)，则其下一代可能出现不良的结局，并导致妊娠的概率降低，流产的概率上升。当然，也有相当比例的学者认为单纯的染色体多态性无法对生殖功能构成影响，与人工辅助生殖的结局也没有必然的联系[15-16]。双方均持有若干的文献证明，但争议至今仍然存在。

本研究对4年以来我中心接诊的男性患者的染色体检查数据进行了回顾性分析。从结果中可见，在全部1 029例患者之中，仅有238例出现染色体多态，比例为7.86%，该比例与若干研究结果报道的数据较为接近。需要注意的是，在近些年以来，男性染色体多态变化的数据呈现出逐渐增高的变化趋势，这可能与外界环境的影响，自然遗传的淘汰，生活方式的转变等均具有密切的关系，而由此是否可以导致人群的生育能力降低，尚缺乏权威的论断。本研究中按照人工助孕的方式和是否出现染色体多态，将全部的男性患者分为4个组。并成对地对两组之间的数据进行对比，探讨在相同助孕方式之下，是否出现染色体多态，对于妊娠结局的影响。

从本研究所罗列的男性患者出现染色体多态的核型分布情况可见，染色体臂间倒位，常染色体次缢痕区加长，D/G组染色体短臂， Y染色体长臂长度变异成为四个分布种类。这也同目前多数研究的结果较为一致[17-19]。

染色体运动以及分离的分子机制研究结果显示，在染色体的主缢痕区，即富含重复碱基序列的异染色质区域的着丝粒，被称为动粒复合体，是细胞分裂中纺锤丝的着力点，也是染色体可以运动，和平均分配到两个细胞的功能以及结构的基础。这种结构和其随体区域毗邻，由于距离相近，随体的变异就可能导致端着丝粒染色体的分离异常，从而使胚胎在发育过程中出现非整倍体的变异，或者在减数分裂中出现异常配子的风险增高，这有可能导致自然流产或者死胎等出现。

次缢痕区主要存在与1号、9号、16号染色体，这些次缢痕区会发生长度的提升、断裂或者远端染色体片段的重复，而这些结构方面的改变有可能最终导致临床病变的出现。次缢痕区大多位于染色体的结构异染色质区域，在这个区域内多由高度重复的DNA序列所构成，也有学者认为次缢痕的增多就是高度重复的DNA序列增多的结果[20]。高度重复的DNA序列会对正常的细胞分裂过程产生影响，导致同源染色体难以配对，也有可能导致不平衡配子出现，因此有可能诱发不孕不育的出现，提醒在临床工作中应给予一定的重视。

染色体的臂间倒位携带者一般外表是正常的，但是在配子的形成过程中，因为同源染色体需要相互配对，在减数分裂的第1次分裂中，将形成一种独特的倒位环。在倒位环内出现同源染色体交换，会出现4种不同的配子，只有一种为正常的染色体，另外一种使倒位染色体，两种为带有重复片段和缺失片段的重排染色体。这形成了不平衡配子，有可能诱发流产、不孕不育或者死胎等生殖异常。一般认为倒位片段的长度越短，则出现重复或者缺失的可能性越大，形成正常配子以及合子的可能性也就越低，导致流产、不孕不育等的风险越高。

Y染色体长臂长度变异主要是指异染色质区的长度增加或者减少。长臂异染色质区的组成部分是Y染色体独特的串联重复序列，在该区域内过度的DNA序列重复可能会导致减数分裂过程中X-Y的配对概率，或者因为斑点位置效应对精子生成基因的表达形成抑制。Y染色体长臂上具有精子分化与发育的基因，若高度重复可造成精子生成障碍或受精能力降低，但长臂距离缩短也意味着基因功能的丢失与精子形成的异常。

尽管在理论上，以上4种主要的男性染色体多态性变异均有可能对妊娠结局产生影响，但是在实际计算结果中，各类人工助孕的结局数据差异均无统计学意义(P>0.05)。出现该种结果的可能原因如下：尽管在理论上，染色体的多态性变化可能对妊娠结局发生影响，但是这仅存在于理论推导和部分实验条件无法绝对标准统一的研究结果中，毕竟对妊娠结局可能产生影响的因素众多，而每种因素能够影响妊娠结局的能力也有较大差异。DNA序列在复制和基因表达的过程中，同时也具有相当的纠错机制作为保护，这在一定程度上也可以对染色体多态性的变异影响产生抑制效果。本研究中并没有将因受精情况不佳、没有合适胚胎抑制的患者的资料纳入进来，推测如果将研究的样本量继续扩大，则有可能出现阳性的结果。

综上所述，宁夏地区的男性不育患者存在一定比例的染色体多态性变异，但是这种变异对于人工助孕的结局没有产生明显的影响，但本结果尚需要进行深入探讨。