中心复合设计法优化葡萄籽中白藜芦醇微波提取工艺

游国叶，胡思宏，史 琼

(信阳职业技术学院，河南 信阳 464000)

白藜芦醇(resveratrol，简称Res)是植物在受到应激时自身合成的一种植物抗毒素，化学名称为(E)-3，4’，5-三羟基二苯乙烯，简称芪三酚，为白色(无色)针状晶体，对光、热不稳定，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，难溶于水[1]。Res具有抗氧化、保护心血管、抗癌、抗糖尿病、保护神经、抗衰老和抗肥胖、抑制血小板凝集和血管舒张、提高机体免疫力等生理及药理作用[1-7]，广泛应用于药品、保健品。目前白藜芦醇的提取研究主要集中在中药材虎杖、花生等植物中，据文献[1]记载葡萄籽中也含有Res，葡萄籽作为葡萄的一部分，每年大量的都被当作废物丢弃，如果加以利用从中提取白藜芦醇，可大大节约中药宝贵药材虎杖的使用量，既节约了成本，又提高了葡萄副产物的附加值。

中心复合设计法(central composite design，CCD)[8-9]是效应面法(response surface methodology，RSM)中最常用的一种设计方案，又名星点设计法，是多因素五水平的试验设计，集数学和统计学方法于一体的新型试验方法，具有复相关系数较高、试验次数少、试验精度高，预测值更接近真实值等优点而被广泛应用。微波提取技术(MAE)具有加热迅速、耗能低、操作时间短、溶剂耗量少、不破坏环境，降低污染，提取效率高等优点[10-11]，近年来广泛应用于中药提取。

通过文献查阅，从葡萄籽中提取Res尚未见有用到CCD优化-微波提取方法。课题组以紫色巨峰葡萄的籽为研究对象，采用微波辅助提取法提取Res，并通过星点设计效应面优化法优化提取工艺，旨在为Res类产品研发提供理论依据和参考。

1 仪器、试剂及材料

1.1 仪器

HC-83203FB微波炉(格兰仕公司)；LC-10AT型高效液相色谱仪，SPD-10AVP型紫外检测器、CBM-102型色谱工作站(日本岛津公司)、Luna C18(250 mm*4.6 mm，5 um)色谱柱；TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE-52AA型旋转蒸发器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KQ5200DB数控型超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

白藜芦醇标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100829-201605，纯度95%)；无水乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、石油醚(分析纯，郑州德众化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司)。巨峰葡萄(购于当地超市，产于湖北荆州埠河镇，批号记为 20190819，20190830，20190916)。将葡萄籽原料烘干后用粉碎机粉碎，过筛，按不同目数分别存储，备用。

2 实验方法

2.1 提取及纯化方法

称取过80目的葡萄籽粉末5.0 g于烧瓶中，加入等体积石油醚提取，弃石油醚层除去脂溶性杂质，按液料比为42:1比例加入76%乙醇后置于微波中500 w处理(6.5 min，60 ℃)，提取液趁热过滤，滤液浓缩回收乙醇后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，40℃下旋干，用甲醇溶解残留物并定容到50 mL，精密移取0.5 mL定容到10 mL容量瓶中，备用。

2.2 HPLC含量测定

将上述提取液稀释后通过0.45 um微孔滤膜，在HPLC仪上按下述色谱条件测定:色谱柱:Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:甲醇-水(75∶25)；流速:1.0 mL/min；检测波长:305 nm；柱温:室温；进样量:20 μL。柱温:室温。

3 结果与讨论

3.1 提取条件的选择

3.1.1 提取溶剂的确定

根据有关文献[1，12-13]，以甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯4种溶剂作提取溶剂，相同条件下对葡萄籽进行提取、过滤、浓缩、萃取，定容到一定体积，按照既定的色谱条件测定，通过比较提取率，确定适宜的提取溶剂。由图1可见不同提取溶剂对葡萄籽中Res的提取效果不同，而且差别较大。不同溶剂提取Res的得率大小依次为甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯。考虑到产品的安全性和成本问题，选择乙醇为提取剂。

图1 提取溶剂对提取率的影响

3.1.2 微波温度的确定

通过前期实验及结合文献[1-2，12-13]，Res对光敏感，极易发生氧化反应而变色，当温度超过60 ℃时稳定性变差，不易储存及后续操作，故实验中确定微波温度为60 ℃，进一步考察其他因素对Res提取得影响。

3.1.3 微波辐射条件的确定

根据笔者单因素考察结果发现，药材粉碎粒度、液料比、微波时间及提取溶剂乙醇浓度的对Res提取率有显著影响，故在此基础上采用中心复合设计法优化提取工艺，本试验以粉碎粒度(A)、液料比(B)、微波时间(C)、提取溶剂浓度(D)为考察自变量，提取率为因变量，根据星点设计原理对各因素进行5水平设计，采用 Design-expert 8.0.6软件安排试验及进行数据分析处理。因素及水平分布见表1，试验安排及结果见表2。

表1 因素与水平表

表2 实验设计与结果

将所得数据采用Design-Expert 8.0.6软件进行模型拟合及方差分析并依据模型做响应面处理。以提取率Y对各因素X进行多元线性回归和二项式方程拟合，得到各因素与提取率之间的回归方程如下，其中多元线性回归方程为Y=2.52+0.16*A+0.26*B+0.21*C+0.42*D( r=0.5035，P=0.0221)；二项式方程为Y=3.75+0.16*A+0.26*B+0.21*C+0.42*D -0.013*A*B+0.077*A*C+0.048*A*D+0.15*B*C-0.12*B*D-0.054*C*D-0.38A2-0.40B2-0.46C2-0.29D2( r=0.9383，P<0.0001)。

由回归方程可看出，多元线性回归方程r = 0.5035，相关度较低，而二项式回归方程r = 0.9383，说明回归方程回归效果好，失拟项F=7.27，P=0.204>0.05，失拟项不显著，说明实验中其他未参与拟合的因素对实验结果影响很小，实测数据和理论数据拟合度很高，试验误差小，可信度大。

由表3回归模型方差结果可得，该模型P<0.0001，说明此模型拟合度极显著，足以拟合试验数据，且方差分析中液料比(B)、微波时间(C)、乙醇浓度(D)的P值均<0.01，表明三者对Res提取影响极显著；而交互项(AB、AC 、AD、BC、BD及CD)的P值均>0.05，说明各因素相互之间的关系不显著；各因素的二次项(A2、B2、C2以及D2)的P值均<0.0001，表明各因素对Res提取率的影响并不是简单的线性关系，而是二次曲线关系；各因素对Res得率影响程度为乙醇浓度(D)>液料比(B)>微波时间(C)>粒度(A)。因此综上所述此模型具有显著的拟合度和预测性，可以用于葡萄籽中Res的提取分析和预测。

表3 方差分析

根据回归方程及CCD设计结果，各因素间交互作用的三维空间曲面图见图2。

图2 响应面图

通过图2的比较，对Res提取量影响最大的因素是乙醇浓度，最小的为药材粒度。这与上述方差分析表得出的结论也是一致的。通过模型拟合及响应面优化，软件给出最佳提取工艺为药材粒度85.64目，液料比42.71，微波时间6.51 min，微波功率为500 W、76.71 %乙醇做提取溶剂，在此条件下Res的得率(预测值)为3.97 mg/g。为便于生产，最终确定Res最佳提取工艺为药材粒度80目，液料比42：1，微波时间6.5 min，微波功率为500 W，76%乙醇做提取溶剂。

为了验证优化试验所的参数的可靠性及模型的准确度，按照响应面法优化的工艺条件进行3批验证，结果Res得率的平均值为3.96 mg/g(RSD=1.53%)，与预测值较吻合，实验结果与模型预测值基本一致，在实际工业化生产过程中，应用优选出的最佳提取工艺可以较好地提高Res的得率，且工艺参数稳定可靠，具有一定的应用价值。结果见表 4。

表4 验证试验结果

3.2 HPLC分析

3.2.1 溶液的制备

①对照品溶液的制备：精密称取Res对照品25 mg，乙醇稀释定容至50 mL容量瓶中，配成浓度为500 ug /mL的标准储备液，密封，冰箱保存，使用时按需逐级稀释。②供试品溶液的制备：按照“2.1”方法提取、纯化即得。③阴性对照溶液：同Res对照溶液配制方法配制不含Res的空白对照溶液，备用。

3.2.2 HPLC测定条件的选择

取Res对照品溶液在200-400 nm波长范围内扫描，可见在305 nm处有最大吸收峰，阴性对照在此处无吸收，故选择305 nm为检测波长。

色谱条件：色谱柱：Luna C18(250 mm*4.6 mm，5 um)；流动相：甲醇-水(75：25)；流速：1.0 L/min；检测波长：305 nm；柱温：室温；进样量：20 uL。可见该色谱条件下，出峰时间为6.3 min，相临邻色谱峰的分离度大于1.5，分离效果良好。色谱图见图3。

图3 HPLC图

3.2.3 线性范围与检测限

吸取Res对照品储备液0.5 mL，流动相定容至10 mL棕色容量瓶中得25 ug/mL储备液，再分别吸取上储备液0.05 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mLl、1.5 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL定容于10mL棕色容量瓶中，按“3.2.2”色谱条件测定，以峰面积对相应质量浓度绘制标准曲线。结果显示，Res在0.125～25 ug /mL范围内与其峰面积呈良好线性关系，回归方程为A= 110280C+ 436304 ，r=0. 9999。检出限及定量限分别为 0.001 ug /mL和0.018 ug /mL。

3.2.4 精密度、重复性及稳定性实验

取Res对照品储备液适量，以流动相稀释，重复测定6次，考察日内精密度，结果显示，日内 RSD为0.19% ，精密度良好；

称取5.0 g葡萄籽干粉6份，按照 “2.1”项下微波提取、纯化方法进行操作，按照“3.2.2”项下色谱条件进样测定，结果显示RSD为0.94%(n=6)，表明重复性良好。

取上供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24 h测定，结果显示RSD为1.60%(n=6)，表明提取液在24 h内稳定。

3.2.5 回收率实验

按照优化实验条件，分别称取已知含量的葡萄籽粉末药材加入Res标准溶液进行加标回收实验，测定含量，计算回收率。平均回收率为 97.57%，RSD 为0.83%。

3.3 提取分析及应用

精密称取3个批次的葡萄籽药材各5.0g，采用星点设计-效应面优化后的最优条件提取药材中的Res，按实验方法进行测定。并采用经正交试验优化后的直接溶剂回流法(SRE)最佳实验条件 (提取温度60 ℃，提取回流时间80 min，液料比80：1，75%乙醇提取，回流2次)进行对比，结果见表5。

表5 不同批次不同方法提取分析结果(n=3)

由表5可知，微波提取效率明显高于SRE，且提取时间大大缩短，这是因为MAE和SRE的加热方式不同。SRE在提取过程中首先是加热溶剂并溶胀样品细胞，以热传导方式将热能从溶剂传递到细胞内部进行加热，存在温度梯度；而MAE是直接穿透容器，物料整体被加热，无温度梯度，物料内外温升均匀，加热速度快、无滞后效应，样品与溶剂在很短的时间内便可升到较高温度，从而有效提高提取效率，且在该提取体系中极性提取溶剂乙醇以可吸收微波，产生较强的能量，有利于药材内的组分溶出。因此，微波辅助提取方法适用于葡萄籽中Res的提取，且该方法简单、方便、实用，在提取应用方面具有良好的前景。

4 结论

本文将微波辅助提取-中心复合设计优选工艺首次应用于葡萄籽中Res的提取，通过单因素试验，确定对提取率影响较为显著的物料粒度、液料比、微波时间及提取溶剂浓度四个因素，然后采用中心复合设计法对提取条件进行了优化，运用Design-expert 8.0.6软件安排试验并进行数据分析处理，所得提取条件(药材粒度80目，液料比42：1，微波时间6.5 min，微波功率为500 W，76%乙醇做提取溶剂)稳定可控，工艺简便，便于工业化生产。并建立了一种简便快速、灵敏度及重现性好、精密度高的 HPLC 测定的分析方法。将本法用于葡萄籽中Res的提取和分析，结果满意，可为白藜芦醇的进一步开发提供科学依据。