铁十字酢浆草不同极性部位的HPLC 指纹图谱与抗氧化活性研究

李萧娜，纪永辉，王京龙，张立华，臧远龙，杨 彬，刘春河，刘春江

（1.枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160；2.枣庄虹合食品科技服务有限公司，山东 枣庄 277800）

酢浆草（Oxalis corniculataL.）为酢浆草科植物酢浆草的新鲜或干燥全草，既是常见的绿化种植花卉，也常作为清热解毒药用，是苗族的传统药材［1］。酢浆草广泛分布于云南、广西、四川等地，大多用作药物。酢浆草富含黄酮类、多酚类、多糖类等多种成分［2，3］，具有清除自由基、防衰老、抗氧化的作用［4，5］。

目前，对于酢浆草的药理研究主要集中在抗炎镇痛作用上，对其抗氧化活性的报道很少。研究表明，人体衰老、血栓形成等许多疾病与自由基有很大的关系，因其具有强氧化性，能攻击生物大分子，进而导致机体组织、细胞受到损伤。因此，评价和筛选具有抗氧化功能的天然抗氧化物，在对人体抗衰老等研究方面占据了重要地位［6］，已经成为国内外学者重点研究的热点问题。

中药化学指纹图谱是一种综合、整体的鉴定手段，强调多组分比例的相对稳定和位置顺序的完整性特征，以及在共同特征的基础上个体之间又互有差异的模糊性特征［7-11］。冯华等［12］采用高效液相色谱法比较了不同产地的酢浆草干燥全草及其混淆品药材的相似度；吴林菁等［13］采用UHPLC，研究了30批15 个不同产地的酢浆草指纹图谱，并标定共有峰24 个。本研究中所用的酢浆草采自云南省，经鉴定为铁十字酢浆草，试验中所用的为其地下鳞茎部分，经不同极性的有机溶剂初步萃取后，通过HPLC 指纹图谱比较其不同部位在不同极性溶剂中的化学成分差异，并探究其抗氧化活性，为铁十字酢浆草的深入研究提供参考［6，14］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilent1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；UV-2600 型全波段紫外可见扫描仪（日本岛津公司）；UV-2000 型紫外-可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-S4 型数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；RE52CS-2 型旋转蒸发器、B-260 型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ5200QDB 型超声波清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）；DHG-92464 型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.1.2 试药 药材采自云南省，经鉴定为酢浆草科植物铁十字酢浆草。没食子酸、芦丁、葡萄糖对照品（质量分数＞98%，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；其他试剂（分析纯，国药集团）。

1.2 方法

1.2.1 酢浆草鳞茎总多酚含量的测定

1）没食子酸标准曲线的制备。精确称量没食子酸标准品100.00 mg，用无水乙醇定容至100 mL，即得没食子酸标准溶液。吸取标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于容量瓶中，加入6 mL 酒石酸亚铁溶液；再用pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液定容至25 mL，静置显色后在540 nm 波长下测定吸光度，重复3 次，取平均值［15，16］。将没食子酸浓度与吸光度进行线性回归，回归方程为y=13.993x+0.009 8，R2=0.999 1。

2）供试品的制备。取酢浆草鳞茎洗净，烘干后粉碎、过筛，保存备用。取外皮、内芯粉末各2.00 g置于烧瓶中，加入适量乙醇溶液，超声30 min 后过滤，吸取滤液3 mL，定容至25 mL 容量瓶中。

1.2.2 酢浆草鳞茎总黄酮含量的测定

1）芦丁标准曲线的制备。称取芦丁标准品20.00 mg，用95% 乙醇溶液溶解，再用50% 乙醇溶液定容到100 mL 容量瓶中，制得标准溶液。吸取标准溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 至容量瓶中，加入50% 乙醇溶液至25 mL，加入亚硝酸钠溶液1.5 mL，加入10% 硝酸铝溶液1.5 mL，再加入1 mol∕L 氢氧化钠溶液20 mL，最后用50% 乙醇溶液定容至50 mL，15 min 后于510 nm 波长下测定吸光度，重复3 次，取平均值［17，18］。将芦丁浓度与吸光度进行线性回归，回归方程为y=10.985x+0.006 3，R2=0.999 8。

2）供试品的制备。取酢浆草鳞茎洗净，烘干后粉碎、过筛，保存备用。分别称取2.00 g 酢浆草鳞茎外皮、内芯粉末置于烧瓶中，加入适量甲醇溶液超声30 min 后过滤，滤液水浴蒸干后加入70% 乙醇溶液溶解，定容至10 mL，即得供试品溶液。

1.2.3 酢浆草鳞茎多糖含量的测定

1）总糖标准曲线的制备。称取葡萄糖标准品10.00 mg，去离子水定容至100 mL，即得葡萄糖标准溶液。吸取标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，补加去离子水至2 mL，加5% 苯酚溶液1 mL，加浓硫酸5 mL，静置10 min，沸水浴加热20 min，取出冷却［19，20］，于487 nm 波长下测定吸光度，重复3 次，取平均值。将葡萄糖浓度与吸光度进行线性回归，回归方程为y=66.84x+0.007 1，R2=0.999 3。

2）还原糖标准曲线的制备。吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于试管中，补加去离子水至2 mL，加2 mL DNS 试剂，沸水浴加热5 min，取出快速冷却［21，22］，在540 nm 波长下测定吸光度，重复3 次，取平均值。将葡萄糖浓度与吸光度进行线性回归，回归方程为y=4.8126x+0.055 1，R2=0.999 4。

3）供试品的制备。分别称取2.00 g 酢浆草鳞茎外皮、内芯粉末置于烧瓶中，加去离子水，超声10 min，沸水浴处理1.5 h 后过滤，取滤液1 mL 定容至25 mL，即为总糖供试液。另取滤液2 mL 定容至10 mL 作为还原糖的供试液。

1.2.4 HPLC 指纹图谱建立

1）供试品的制备。取酢浆草鳞茎洗净，烘干后粉碎、过筛，保存备用。分别称取酢浆草鳞茎外皮、鳞茎内芯粉末8 g 置锥形瓶中，按料液比1∶10 加入70% 乙醇溶液，超声振荡提取3 次，收集滤液，减压浓缩得浸膏，加入去离水定容至50 mL。分别取酢浆草鳞茎外皮和内芯10 mL 溶液水浴挥干，用甲醇溶解定容。剩余40 mL 用等体积石油醚萃取，直至石油醚层无色。合并萃取液并减压浓缩，残渣即为石油醚相。剩余水相水浴挥尽石油醚，等体积氯仿萃取，直至氯仿层无色，合并萃取液并减压浓缩，制得氯仿相。同法分别制备乙酸乙酯相、水饱和的正丁醇相。将石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇、水相水浴蒸干，用甲醇溶解定容，为不同极性部位的供试品溶液。

2）色谱条件。Agilent C18色谱柱，流动相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，10%～20% B；15～55 min，20%～50% B；55～75 min，50%～70% B；75～80 min，70%～80% B；80～100 min，80%～90%B；100～115 min，90%～100%B）；流速1 mL∕min；柱温25 ℃；检测波长280 nm；检测时间115 min；进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 不同部位酢浆草鳞茎中活性成分含量的测定结果

酢浆草鳞茎不同部位中活性成分含量测定结果如表1 所示。

表1 不同部位活性成分的含量

2.2 HPLC 指纹图谱建立及分析

2.2.1 方法学验证

1）稳定性试验。取同一批酢浆草供试液20 μL，分别于0、4、8、12、24 h 考察指纹图谱，结果显示共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%。

2）精密度试验。取相同的供试液20 μL 连续进样6 次，统计共有峰的相对峰面积、相对保留时间，其中峰面积比值的RSD小于3%，符合指纹图谱的要求，仪器精密度良好。

3）重现性试验。取同一批次的酢浆草供试液，在指定色谱条件下，检测指纹图谱，相对峰面积的RSD小于3%。

2.2.2 酢浆草鳞茎醇提液HPLC 指纹图谱 精密吸取酢浆草供试品溶液各20 μL，分别进样，经梯度洗脱，记录HPLC 指纹图谱，酢浆草鳞茎外皮、内芯醇提液HPLC 指纹图谱如图1。

图1 酢浆草鳞茎醇提液指纹图谱

酢浆草鳞茎外皮、内芯醇提液相对保留时间和指纹图谱比较分析见表2。分析酢浆草鳞茎外皮、内芯总醇提液的指纹图谱，以21 号峰为基准峰，结果标定醇提液外皮共有峰32 个，内芯31 个。内芯（B）与外皮（A）相比，缺失5 号特征峰。总峰面积：总醇提液外皮（A）＞总醇提液内芯（B）。

表2 酢浆草鳞茎醇提液指纹图谱分析

2.2.3 酢浆草鳞茎不同极性部位HPLC 指纹图谱

1）酢浆草鳞茎外皮不同极性部位HPLC 指纹图谱。精密吸取酢浆草供试品溶液各20 μL，分别进样，经梯度洗脱，记录HPLC 指纹图谱，酢浆草鳞茎外皮不同极性部位HPLC 指纹图谱叠加如图2。酢浆草鳞茎外皮不同极性部位HPLC 指纹图谱比较分析见表3。

表3 酢浆草鳞茎外皮不同极性部位指纹图谱比较分析

图2 酢浆草鳞茎外皮不同极性部位指纹图谱叠加图

经分析得到酢浆草鳞茎外皮不同极性部位的共有峰，其中石油醚相（A1）8 个，氯仿相（A2）22 个，乙酸乙酯相（A3）22 个，正丁醇相（A4）26 个，水相（A5）9个。总峰面积：A2＞A3＞A4＞A1＞A5。

2）酢浆草鳞茎内芯不同极性部位HPLC 指纹图谱。精密吸取酢浆草供试品溶液各20 μL，分别进样，经梯度洗脱，记录HPLC 指纹图谱，酢浆草鳞茎内芯不同极性部位HPLC 指纹图谱叠加如图3。酢浆草鳞茎内芯不同极性部位HPLC 指纹图谱分析见表4。

表4 酢浆草鳞茎内芯不同极性部位HPLC 指纹图谱比较分析

图3 酢浆草鳞茎内芯不同极性部位指纹图谱叠加图

经分析得到酢浆草鳞茎内芯不同极性部位的共有峰，其中石油醚相（B1）14 个，氯仿相（B2）21 个，乙酸乙酯相（B3）17 个，正丁醇相（B4）19 个，水相（B5）10 个。总峰面积：B2＞B4＞B5＞B1＞B3。

2.2.4 HPLC 指纹图谱相似度评价 以铁十字酢浆草鳞茎外皮和内芯不同极性部位的32 个共有峰峰面积，采用夹角余弦值进行相似度分析。

1）鳞茎同部位不同极性的图谱相似度。酢浆草鳞茎同一部位在不同极性溶剂中指纹图谱相似度计算分析结果见表5。不同极性部位外皮的夹角余弦值中，氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相的相似度大于0.9，化学组成相似，不同极性内芯相似度有差异，在其化学组成上存在一定差异。

表5 同部位不同极性指纹图谱相似度结果

2）鳞茎同极性不同部位的图谱相似度。酢浆草鳞茎不同部位在相同极性溶剂中指纹图谱相似度计算分析结果见表6。相同极性不同部位的夹角余弦值中，醇提液、氯仿相外皮和内芯相似度大于0.9，酢浆草外皮和内芯在醇提液、氯仿相其化学成分相似。乙酸乙酯相外皮和内芯相似度比较小，化学成分可能存在差异。

表6 同极性不同部位指纹图谱相似度结果

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）清除率的测定 取不同浓度供试液3.0 mL 置于试管中，加入3.0 mL 0.20 mmol∕L 的DPPH 溶液，充分振荡，室温暗处反应30 min，测定517 nm 波长处吸光度A，同时测定3.0 mL 无水乙醇和3.0 mL DPPH 混合液的吸光度为A1，测定3.0 mL 供试液和3.0 mL 无水乙醇混合液的吸光度为A2，以无水乙醇作空白，重复3 次，按下面公式计算清除率。同法操作，以抗坏血酸为阳性对照［15，16］。

DPPH·自由基清除率D=［1-（A-A2）∕A1］×100%

2.3.2 羟基自由基（·OH）清除率的测定 将供试品溶液稀释至不同的浓度，按下表自上而下加入试剂，加入样品、硫酸亚铁溶液后充分震荡混匀［17-19］，所加试剂见表7。

表7 试剂加样

在加入以上试剂后，在37 ℃水浴中静置60 min，在536 nm 波长下测定吸光度A样、A损、A未损，重复3 次，按下面公式计算清除率。同法操作，以抗坏血酸为阳性对照。

·OH 自由基清除率D=（A样-A损）∕（A未损-A损）×100%

2.3.3 酢浆草鳞茎不同极性部位抗氧化活性测定分析

1）不同极性部位对1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的清除率。酢浆草鳞茎外皮不同极性部位对DPPH·自由基的清除率如图4，内芯不同极性部位对DPPH·自由基的清除率如图5。由图4 可知，鳞茎外皮对DPPH·自由基的清除率：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相。由图5可知，鳞茎内芯对DPPH·自由基的清除率：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相。

图4 外皮不同极性部位对DPPH·自由基的清除率

图5 内芯不同极性部位对DPPH 自由基的清除率

2）不同极性部位对羟基（·OH）自由基的清除率。酢浆草鳞茎外皮不同极性部位对·OH 自由基的清除率如图6，内芯不同极性部位对·OH 自由基的清除率如图7。由图6 可知，鳞茎外皮对·OH 自由基的清除率：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相。由图7 可知，鳞茎内芯对·OH 自由基的清除率：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相。

图6 外皮不同极性部位对·OH 自由基的清除率

图7 内芯不同极性部位对·OH 自由基的清除率

3 小结与讨论

采用的铁十字酢浆草鳞茎中富含多酚、黄酮、多糖类等成分，采用酒石酸亚铁显色法、亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法、硫酸-苯酚法与DNS 法，所采用方法均为常用的经典传统方法，符合方法学要求，测得其总量分别为：10.18、24.33、138.02 mg∕g，可见酢浆草鳞茎外皮与内芯活性成分总含量有一定差异。

在抗氧化活性测定体系中，不同极性的鳞茎外皮和内芯都有的抗氧化能力。鳞茎外皮对·OH 自由基的清除率为：氯仿相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相＞水相，鳞茎内芯对·OH 自由基的清除率为：氯仿相＞正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相，可见鳞茎外皮和内芯的氯仿相比其他相具有更高的抗氧化能力，且氯仿相指纹图谱峰面积大，信息量丰富，后续可对酢浆草鳞茎的氯仿相深入探究。

建立了其鳞茎外皮和内芯不同极性部位的HPLC 指纹图谱，并探究其抗氧化活性。经对比分析酢浆草鳞茎不同极性的HPLC 指纹图谱，发现各相峰面积都有一定差异。以21 号峰为基准峰标定醇提液外皮共有峰32 个，内芯31 个。其中，总醇提液外皮的指纹图谱明显优于内芯，在外皮中存在5号特征峰，峰面积较大，内芯中未出现，可进一步对此峰进行研究。且总醇提液峰面积外皮远大于内芯。不同极性部位共有峰外皮为石油醚相8 个、氯仿相22 个、乙酸乙酯相22 个、正丁醇相26 个、水相9 个、内芯为石油醚相14 个、氯仿相21 个、乙酸乙酯相17 个、正丁醇相19 个、水相10 个。鳞茎外皮不同极性部位中特征峰数目多，峰面积大，信息量丰富。总峰面积中，外皮和内芯都是氯仿相峰面积最大，数量多，且外皮其他各个极性部位指纹图谱信息量都远大于内芯。

对酢浆草鳞茎外皮和内芯不同极性部位的32个共有峰峰面积进行相似度分析发现，酢浆草鳞茎外皮和内芯在氯仿相中相似度大于0.9，而且氯仿相的抗氧化能力最高，外皮和内芯的氯仿相萃取物化学成分相似。酢浆草鳞茎的相同部位在不同极性中，鳞茎外皮的氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相均大于0.9，乙酸乙酯相与正丁醇相相似度接近。在抗氧化测定中，鳞茎外皮的乙酸乙酯相与氯仿相自由基清除率相近，所以在这两相中酢浆草鳞茎外皮的化学组成可能相似。大多中药质量的评价只探究药材的同极性同部位指纹图谱，不利于精细分析质量，本试验对铁十字酢浆草不同极性部位的指纹图谱、抗氧化活性进行探究并考察相似度，能够更加全面评价中药质量。

铁十字酢浆草作为常见花卉，有着较大的栽培面积，其药用部位多为地上全草部分。本试验发现，其地下鳞茎部分化学成分丰富，并且鳞茎外皮不同极性部位HPLC 指纹图谱更能全面反映酢浆草的化学组成信息，反映出其较好的抗氧化活性。本研究结果铁十字酢浆草地下鳞茎富含活性成分，具备较好的抗氧化作用，为该植物的综合开发利用提供科学支撑。