张 鑫,刘文竹,张 艳,李滢倩,郜金金
(1.吉林省食品检验所,吉林 长春 130103;2.吉林省正恒检测有限公司,吉林 长春 130033)
氨基酸在医药上主要用来制备复方氨基酸输液,也用作治疗药物和用于合成多肽药物。此外氨基酸衍生物在癌症治疗上出现了希望。[1]目前氨基酸的分析方法[2]主要有化学方法、荧光光谱法、电化学方法和分光光度法等.全自动氨基酸分析仪[3-7]与其他方法相比,具有灵敏度高、检出限低、操作简单、数据容易分析等优势。本研究运用全自动氨基酸分析仪测定药品中16种氨基酸的方法,节省前处理时间,降低检测成本。
L-8900高速氨基酸分析仪(日本日立公司);BGZ-246电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);AB204-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜
混合氨基酸标准品(1 mL,2.5mmol/mL,SIGMA);蛋白水解液用缓冲液PH套装MCI BufferL-8500-PH Kit(WAKO);茚三酮显色液 NINHYDRIN COLORING SOLUTION KIT FOR HITACHI(WAKO);盐酸(优级纯);实验室用水为Milli-Q超纯水。
1.2.1 溶液配制:16种混合氨基酸标准溶液配制;50%盐酸溶液配制:将优级纯盐酸与水等体积混合。
1.2.2 样品的前处理:称取适量样品(氨基酸含量约在10 mg~20 mg)置聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,加入50%盐酸溶液15 mL,混匀后,在140℃干燥箱中水解4 h,转移全部水解液置50 mL容量瓶中,加入超纯水定容至刻度线,混匀后,从中取出10 mL溶液置50 mL容量瓶中,加入超纯水定容至刻度线,混匀,过滤,上机。
1.2.3 氨基酸分析仪仪器运行条件:荧光检测器;检测波长440、570 nm;离子交换色谱柱;柱温57℃;柠檬酸缓冲液;进样体积20 μL;流速0.4 mL/min。
样品水解后,运用氨基酸全自动分析仪测定,脯氨酸在波长440 nm测定,其余15种氨基酸在570 nm波长下测定,16种氨基酸在该分离条件下达到很好的分离效果,16种氨基酸标样色谱见图1和图2,横坐标为保留时间(min),纵坐标为振幅(mv)
称取适量样品(氨基酸含量约在10 mg~20 mg)置聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,加入50%盐酸溶液15 mL,混匀后,干燥箱温度保持在140℃,水解时间分别为60 min、120 min、180 min、240 min、300 min,按照1.2.2样品的前处理方法进行,随着水解时间的增加,16种氨基酸的回收率逐渐增大,但在干燥箱中水解时间在240 min以上,回收率达到100%左右,继续增加水解时间,回收率变化不大,因此确定样品在干燥箱中最佳水解时间为240 min。
称取适量样品(氨基酸含量约在10 mg~20 mg)置聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,加入50%盐酸溶液15 mL,混匀后,干燥箱中水解240 min,干燥箱温度分别为50℃、80℃、110℃、140℃、170℃,按照1.2.2样品的前处理方法进行,随着干燥箱中温度逐渐增加,16种氨基酸的回收率也在逐渐增大,在干燥温度为140℃时,回收率达到100%左右,继续增加干燥温度,回收率变化不大,因此确定样品在干燥箱中最佳干燥温度为140℃。
按照2.2和2.3中确定的样品前处理最佳水解时间240min和干燥温度140℃,重新处理6份样品,考察仪器的精密度,同样是以回收率的RSD值为判定依据,结果显示出16种氨基酸精密度很好均小于2.0%。
为考察该方法的线性关系,准确配制了16种氨基酸浓度分别为的混合标准溶液,按1.2.2前处理条件进行分析,以f(x)值为峰面积,x值为检测浓度,得到标准曲线。该测定方法具有较宽的线性范围,16种氨基酸的线性范围为,线性回归系数均达到0.999以上;16种氨基酸的方法检出限范围在0.17~0.51 μmol/L。说明用该方法检测中的16种氨基酸是可行的。
通过对样品前处理的简化,建立了运用氨基酸分析仪检测药品中氨基酸含量的方法。该方法不同于以往的前处理方法繁琐、复杂、耗时长,整个方法的前处理时间简短,操作简单,同时能得到较低的方法检出限和高效、稳定的回收率要求,该方法适用于各种样品中氨基酸含量的检测。