离舌橐吾根部的抗肿瘤活性成分研究

徐 栋，刘 丹，张晨欢，张润芳，王钦莲，邹 坤，2，王 慧，2*

(1.三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)，湖北 宜昌 443002;2.三峡大学生物与制药学院中国轻工业功能酵母重点实验室，湖北 宜昌 443002)

菊科植物离舌橐吾L.veitchiana(Hemsl.)Greenm.在民间应用广泛，具有润肺下气、清热解毒、抗菌消炎、化痰止咳和活血止痛等功效；主要用作治疗流行性感冒、咳嗽、溃疡和肺结核等症[1].本课题组前期对其根茎醇提物的乙酸乙酯萃取部位进行了系统研究，从中分离鉴定了13个艾里莫酚烷型倍半萜[1].为了深入研究离舌橐吾根部抗肿瘤活性物质，本实验探究了其醇提物石油醚萃取部位的化学成分，从中分离得到7个单体化合物，分别鉴定：bakkenolide A (1)，phthalic acid isodibutyl ester(2)，dibutylphthalate(3)，eremophila-7 (11)，9-dien-8-one(4)，6β，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(5)，6β-hydroxy-eremophil-7(11)-en-12，8β-olide(6)和6β-Hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(7).其中，化合物1为首个从离舌橐吾中发现的具有螺环骨架的倍半萜类化合物，6和7为一对非对映异构体.采用MTT法对所有化合物针对人胃癌细胞株(HGC-27)的体外抗肿瘤细胞抑制活性进行评价，结果表明化合物1对人胃癌细胞 HGC-27具有显著的细胞毒抑制活性，其IC50为31.10 μg·mL-1.

1 仪器与材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；LC-6AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；YMC-Pack ODS-A色谱柱(250 mm × 10 mm，10 μm，半制备型，日本YMC公司)；Bruker AV 400核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；Thermo Scientific ISQ LT单四极杆质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；低温冷冻干燥机(美国Labconco公司)；生物安全柜(Telstar Bio II Advance)；细胞培养箱(Thermo scientific)；倒置显微镜(Olympus CKX41)；离心机(Thermo scientific SORVALL ST16)；酶标仪(瑞士Tecan)；正相色谱硅胶和薄层色谱硅胶板GF254均为青岛海洋化工有限公司产品；反相色谱硅胶为日本YMC公司产品；色谱纯甲醇、乙腈为美国TEDIA公司产品，其他分析纯试剂均为天津科密欧化学试剂有限公司产品.

离舌橐吾药材于2017年7月采自湖北省神农架林区，经三峡大学生物与制药学院王玉兵博士鉴定为离舌橐吾L.veitchiana，植物标本(LV2017001)存放于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室.

人胃癌细胞(HGC-27)由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室提供.

2 提取与分离

离舌橐吾药材根部9.60 kg，自然晾干，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次48 h，合并提取液，减压浓缩得总浸膏并用水分散后.萃取溶剂依次为石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯及正丁醇，最终经减压浓缩获得石油醚萃取部位.将石油醚部位(90.3 g)采用正相硅胶(200～300目)柱色谱分离，石油醚∶丙酮(100∶0→2∶1)进行梯度洗脱，得到151个流分.TLC分析后，合并Fr.35-37(733.3 mg)，经制备型HPLC分离(乙腈—水65∶35，3 mL·min-1)得到7个流分(Frr.1～7)，Frr.5(76.0 mg)经制备型HPLC分离(乙腈—水62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物1(8.7 mg)和化合物2(3.2 mg)；合并Fr.38～41(981.1 mg)，经制备型HPLC分离(乙腈—水62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物3(2.8 mg)和4(10.5 mg)；合并Fr.45～48(4 575.2 mg)，经反相硅胶柱(甲醇—水：30%→100%)分离，得Frr.1～44，对Frr.9(184.1 mg)，经高效液相色谱半制备分离纯化(乙腈∶水=62∶38，3 mL·min-1)，得到化合物5(7.9 mg)；对Frr.10(392.2 mg)，经高效液相色谱半制备分离纯化(乙腈∶水=55∶45，3 mL·min-1)，得到化合物6(11.9 mg)和7(4.7 mg).

图1 化合物1～7的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-7

3 结构鉴定

化合物1为无色固体，易溶于氯仿；EI-MSm/z：234 [M]+，分子式C15H22O2；1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=6.8 Hz，15-CH3)，0.92(3H，s，14-CH3)，4.70(2H，m，H-12)，4.96(1H，t，J=2.3 Hz，H2-13b)，5.04(1H，t，J=2.3 Hz，H2-13a)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.4(C-14)，19.2(C-15)，21.0(C-2)，23.4(C-1)，30.9(C-3)，33.9(C-4)，42.4(C-9)，44.0(C-5)，46.2(C-10)，48.6(C-6)，49.9(C-7)，70.4(C-12)，105.8(C-13)，150.4(C-11)，182.6(C-8).以上数据与文献报道的bakkenolide A[3]数据基本一致，故鉴定化合物1为bakkenolide A.

化合物2为无色固体，易溶于氯仿；EI-MSm/z：278 [M]+，分子式C16H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:1.00(6H，d，J=7.2 Hz，H3-3′，H3-1″)，2.05(1H，m，J=7.2 Hz，H-2′)，4.10(2H，d，J=7.2 Hz，H-1′)，7.54(1H，m，J=6.0 Hz，H-4，5)，7.74(1H，m，J=6.0 Hz，H-2，6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：19.2(C-3′，1″)，27.8(C-2′)，71.8(C-1′)，128.9(C-4，5)，131.0(C-2，6)，132.4(C-1，2)，167.7(C=O).以上数据与文献报道的phthalic acid isodibutyl ester[4]数据基本一致，故鉴定化合物2为phthalic acid isodibutyl ester.

化合物3为无色油状物，易溶于氯仿;EI-MSm/z：278 [M]+，分子式C16H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7.72(2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.54(2H，dd，J=5.7，3.3，H-4，5)，4.31(4H，t，J=6.7 Hz，H-1′)，1.73(4H，m，H2-2′)，1.45(4H，m，H-3′)，0.97(6H，t，J=7.4 Hz，H3-4′).13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：13.8(C-4)，19.2(C-3)，30.6(C-2)，65.6(C-1)，128.9(C-3，6)，131.0(C-4，5)，132.3(C-1，2)，167.8(COO-).以上数据与文献报道的dibutyl phthalate[4]数据基本一致，故鉴定化合物3为dibutyl phthalate.

化合物4为无色油状物，易溶于氯仿；EI-MSm/z:218 [M]+，分子式 C15H22O；1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，0.97(3H，s，14-CH3)，1.83(3H，s，13-CH3)，2.09(3H，d，J=2.0 Hz，12-CH3)，5.74 (1H，dd，J=1.7，0.7 Hz，H-9)；13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ：15.5(C-15)，16.1(C-14)，22.1(C-12)，22.6(C-13)，26.5(C-2)，30.6 (C-1)，32.6(C-3)，41.1(C-6)，41.9(C-5)，42.5(C-4)，126.2(C-9)，128.2(C-7)，142.3(C-11)，168.8(C-10)，192.4(C-8).以上数据与文献报道的eremophila-7(11)，9-dien-8-one[5]数据基本一致，故鉴定化合物4为 eremophila-7(11)，9-dien-8-one.

化合物5为无色固体；EI-MSm/z:266 [M]+，分子式C15H22O4；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:0.79(3H，d，J=6.0 Hz，15-CH3)，1.14(3H，s，14-CH3)，1.89(3H，s，13-CH3)，4.62(1H，s，H-6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.6(C-13)，16.2(C-14)，16.3(C-15)，20.0 (C-2)，25.5 (C-1)，29.6(C-4)，30.6(C-3)，33.8(C-10)，39.1(C-9)，43.3(C-5)，70.9(C-6)，103.9(C-8)，125.0(C-11)，155.0(C-7)，171.4(C-12).以上数据与文献报道的 6β，8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide[6]数据基本一致，故鉴定化合物5为6β，8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide.

化合物6为无色固体；EI-MSm/z:250 [M]+，分子式C15H22O3；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ：0.81(3H，s，14-CH3)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，2.03(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.80(1H，m，H-8)，5.07(1H，s，H-6)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.2(C-15)，19.0(C-14)，20.2(C-2)，28.4(C-1)，28.4(C-3)，31.8(C-4)，35.4(C-10)，36.0(C-9)，44.8(C-5)，71.4(C-6)，77.5(C-8)，122.3(C-11)，162.5(C-7)，174.9(C-12).以上数据与文献报道的 6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide[7]数据一致，故鉴定化合物6为6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide.

化合物7为无色固体；EI-MSm/z:250 [M]+，分子式C15H22O3；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:0.79(3H，d，J=6.4 Hz，15-CH3)，1.12(3H，s，14-CH3)，1.87(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.70(1H，s，H-6)，5.10(1H，ddd，J=10.6，6.9，1.8 Hz，H-8)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.3 (C-15)，16.4(C-14)，20.0(C-2)，25.8(C-1)，29.5(C-4)，30.6 (C-3)，33.8(C-10)，35.0(C-9)，42.9(C-5)，70.1(C-6)，78.3(C-8)，121.9(C-11)，161.2(C-7)，174.7(C-12).以上数据与文献报道的6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide[8]数据基本一致，故鉴定化合物7为6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide.

4 体外细胞毒活性筛选

采用MTT 比色法测试所有化合物的体外抑制人胃癌细胞 HGC-27活性.收集处于对数生长期的人胃癌细胞HGC-27，制成单细胞悬液，培养液稀释后，以每毫升(0.8～1)× 105个的密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养箱中正常培养24 h后，将不同浓度(3.125，6.25、12.5、25、50 μg·mL-1)的化合物加入孔中，每个浓度3个复孔，每孔终体积为 200 μL，另设空白对照孔若干，每孔加入100 μL的培养液.培养48 h后，于每孔加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)染色，继续培养4 h，吸去原培养液，每孔加入DMSO 150 μL，低速震荡5 min，使结晶物充分溶解，并用酶标仪在波长570 nm下测定吸光值，根据吸光度计算半数抑制浓度(IC50，μg·mL-1).结果显示化合物1对HGC-27细胞的体外抑制作用较强，其IC50为31.10 μg·mL-1，其他化合物对HGC-27细胞的IC50均大于50 μg·mL-1.

5 结果与讨论

离舌橐吾中含有萜类、甾醇类和皂苷类化合物，其中萜类化合物是离舌橐吾的主要化学成分，具有体外抗肿瘤活性[9].目前，国内外学者对离舌橐吾抗肿瘤活性物质基础研究较少，仅从离舌橐吾中分离鉴定了1个具有体外抗肿瘤活性的萜类化合物eremophil-6-en-11-ol，其对人肺腺癌细胞(A549)和人胃腺癌细胞(BCG823)的IC50分别为10.27和31.34 μg·mL-1[10].

为了深入研究离舌橐吾抗肿瘤活性成分，本实验采用多种柱色谱技术结合波谱技术，从离舌橐吾根部醇提物石油醚萃取部位中分离鉴定了7化合物，即：bakkenolide A (1)，phthalic acid isodibutyl ester (2)，dibutyl phthalate (3)，eremophila-7(11)，9-dien-8-one(4)，6β，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(5)，6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8β-olide(6)和6β-Hydroxyeremophil-7(11)-en-12，8α-olide(7).化合物1，2，4和7为首次从该植物分离得到，化合物6和7为一对非对映异构体.用MTT法测定了所有化合物的体外抗肿瘤活性，结果表明化合物1对人胃癌细胞(HGC-27)具有良好的抑制活性，其IC50为31.10 μg·mL-1，其他化合物对HGC-27细胞的IC50均大于50 μg·mL-1.

化合物1为首个从离舌橐吾中分离得到的具有螺环骨架的倍半萜内酯类化合物.倍半萜广泛存在于植物、微生物、海洋生物及某些昆虫体内，具有多种生物活性.倍半萜内酯抗肿瘤作用机制复杂多样，主要包括[11]：1)逆转肿瘤细胞的耐药性；2)控制Ca2+通道的释放；3)影响肿瘤细胞的分裂周期；4)抑制DNA拓扑异构酶；5)抗血管生成；6)抑制细胞迁移；7)诱导细胞凋亡作用；8)双向调节和提高免疫能力.已有研究发现，α-亚甲基-γ丁内酯环是倍半萜内酯的抗肿瘤活性基团[11].因此，推测化合物1的体外抗肿瘤活性可能与其α-亚甲基-γ丁内酯环有关，其抗肿瘤作用机制有待进一步研究.本研究成果丰富了离舌橐吾化学成分多样性，并为阐明离舌橐吾抗肿瘤活性物质基础提供了实验依据.