苦丁茶主物质提取及其HPLC指纹图谱分析

胡 婷，邹成梅，江吉周,2*

(1.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，武汉 430205；2.湖北省地质实验测试中心自然资源部稀土稀有稀散矿产重点实验室，武汉 430034)

苦丁茶，冬青科冬青属植物，是一种常绿乔木，俗称茶丁、富丁茶、皋卢茶，分布在西南地区及华南地区，在我国民间用于防病治病已经具有悠久的历史[1].苦丁茶多糖具有抑制特定脂肪细胞的增值和分化的功效[2-5]，黄酮类能通过调节基因片段抑制癌细胞的扩散[6].苦丁茶多酚具有良好的抗氧化活性和保肝功能.潘研霞等[7]建立小鼠四氯化碳诱导肝损伤模型，在添加剂量苦丁茶多酚成分后，小鼠的肝指数下降，小鼠血清中AST、ALT、TG、TC含量减少，病理学形态观察证明苦丁茶多酚能缓解四氯化碳诱导的肝细胞损伤.Wan等[8-9]研究表明，苦丁茶中的双酚基奎酸能减轻小鼠结肠炎炎疾病活动指数，促炎细胞因子，苦丁茶活性物质是通过调节肠道微生物群来改善结肠炎病症.苦丁茶主成分提取方法常见的有酶解法、微波辅提和超声辅提法等.张海全[10]采用纤维素酶对苦丁茶熊果酸进行酶解，对酶解中的温度、pH等影响因素进行考察，提取率较高.

高效液相色谱(HPLC)是分析复杂样品中占据特殊地位，是检测如中草药等物质的重要技术手段，HPLC能清晰分辨药物中的各类活性物质，通过对分离条件的优化，能提高物质的分离效果，在食品、药品分析等领域使用广泛，也在指纹图谱的分析中常见其身影[11-13].中药指纹图谱能运用现代分析技术获得标示某种药材成分的色谱，从而较全面地反映植物内在组分群的种类和数量，最终客观评价中药质量的科学方法，成为分析药物化学成分的常用手段[14-15].在苦丁茶成分提取并初步优化的基础上[16]，选择色谱条件，为建立指纹谱图提供良好基础.明确苦丁茶化学组成，可以通过指纹图谱的建立实现，对其成分的表征和对不同产地苦丁茶成分的研究，分析其中差异，能够为其药效物质基础研究以及质量控制奠定基础[17].

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10个批次的苦丁茶分别来自海南(S1～S5)、江西(S6、S7)、云南(S8、S9)和福建(S10)四个地区不同药房采购.

甲醇、乙腈：色谱级，天津市化学试剂一厂；甲醇、乙醇、乙酸：分析级，天津市化学试剂一厂.

KL-100超声清洗仪：深圳市科力超声清洗设备有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱：安捷伦科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 试品溶液的制备 样品预处理：苦丁茶粉碎成末，过60目筛得到苦丁茶粗粉样品.准确称取2.0 g苦丁茶粗粉，加入25 mL 75%乙醇溶液提取，提取30 min后抽滤，使用旋转蒸发仪浓缩，浓缩完成后在25 mL容量瓶定容，补充提取剂至刻度线，摇匀备用.吸取1 mL提取液过0.45 μm滤膜，装入HPLC样品瓶中待测.

1.2.2 优化实验条件[18]

1) 提取方法的选择.按料液比为1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，采取超声和加热回流两种提取方法，提取30 min后抽滤，使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩完成后补充提取剂至相同体积，并摇匀.从中吸取1 mL溶液过0.45 μm滤膜，将滤液放入HPLC样品瓶中，通过检测选择提取效果最佳的提取方式.

2) 提取溶剂的选择.按料液比为1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和7种不同提取剂各25 mL，(水和不同体积分数25 mL的乙醇、甲醇，如50%乙醇、甲醇、75%乙醇、甲醇、100%乙醇、甲醇，)，超声提取30 min后抽滤，使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩完成后补充提取剂至相同体积，并摇匀.从中吸取1 mL溶液过0.45 μm滤膜，将滤液放入HPLC样品瓶中，通过检测选择最佳的提取剂.

3) 超声时间的选择.按料液比为1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，在超声时间(30、60、90、120 min)下提取，提取完成后抽滤，使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩完成后添加溶剂至原来体积位置，并摇匀.从中吸取1 mL溶液过0.45 μm滤膜，将滤液放入HPLC样品瓶中，通过检测选择最佳的提取时间.

4) HPLC色谱条件的选择[19-21].按料液比为1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，超声提取30 min后抽滤，使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩完成后补充提取剂至相同体积，并摇匀.从中吸取1 mL溶液过0.45 μm滤膜，将滤液放入HPLC样品瓶中，确定检测波长为260 nm，在检测过程中，考察不同比例流动相(甲醇和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸；乙腈和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸)、缓冲液的洗脱方式及流速(0.2 mL·min-1、0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1)等各个条件下的HPLC色谱的出峰情况.

1.2.3 参照峰的选择 按料液比为1∶12.5 g·mL-1，添加标品绿原酸2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，即得绿原酸对照品溶液.从中吸取1 mL溶液过0.45 μm滤膜，将滤液放入HPLC样品瓶中，通过检测考察绿原酸对照品的出峰情况.

1.2.4 指纹图谱的建立与评价 样品检测后所得各个批次苦丁茶的HPLC指纹图谱，将数据结果放入“中药指纹图谱相似度评价系统2004A版”中进行处理与分析，生成10批苦丁茶样品的HPLC指纹图谱.

1.2.5 方法学考察

1) 精密度试验.在已经确定的色谱分析条件下，对批号为S1的苦丁茶试品溶液连续进样5次，记录260 nm波长下色谱图，根据有关资料的查询，选择参照峰为绿原酸，作为计算的依据，参照峰和保留时间被确定为1，连续5次进样后，可获得对应的RSD值.

2) 稳定性试验.S1批次的苦丁茶按要求制成样品溶液，设置已确定的色谱条件，选择时长为0、2、4、6、12 h，绿原酸为参照峰，计算RSD值.

3) 重复性试验.S1批次的苦丁茶样品，按优化方案下1.2.2项中显示方法，按照相同标准平行配置5份样品溶液，根据已经确定的色谱条件检测，绿原酸为参照峰，计算RSD值.

2 结果与分析

2.1 提取方法的选择

如图1所示，采用相同的提取试剂，两者所得HPLC指纹图谱出峰时间及种类都非常相似.但超声提取法的操作可控性更高，所以选择超声辅提方式获得提取物.

图1 提取方法的考察Fig.1 Investigation of extraction methods

2.2 提取试剂的选择

选择以超声提取法作为提取方式后，考察比较不同提取剂对苦丁茶主成分提取的影响.如图2所示，在各提取剂的HPLC图谱中，主成分的种类相同，从图中可以看出，进样量相同时提取率存在差别，其中75%乙醇的分离效果更好，即选75%乙醇作为提取溶剂来进行后面的实验.

图2 提取溶剂的考察Fig.2 Investigation of extraction solvents

2.3 超声时间的选择

如图3所示，使用75%乙醇进行超声提取，不同提取时间的指纹图谱中提取率的变化不明显，随着时间的增加主物质的提取率并未出现增长的现象，从图中可以看出，提取120 min后，含有的主成分量降低，超声波具有的机械效应会增大介质的运动速度，使提取剂与所提物质充分接触提高提取率，与此同时也会造成极大的破坏作用，苦丁茶在较长时间的超声震动中，会导致结构一定程度的分解，影响主成分的提取，因此提取时间过长是不适宜的，综合整体情况考虑，30 min的提取时间是合适的选择.

图3 提取时间的考察Fig.3 Investigation of extraction time

2.4 HPLC色谱条件的选择和优化

2.4.1 流动相系统的选择 采取5种不同系统的流动相解决苦丁茶中含有少量绿原酸带来的拖尾现象，尽管在加入三乙胺后状况有所改善，但其自身对实验会造成一定的影响，因此改变系统中的流动相能从根本上解决两者的困扰.如图4所示，在未添加冰醋酸(甲醇—水、乙腈—水)系统中的分离效果较添加冰醋酸的效果差，出现明显拖尾现象，不作为考虑对象.在加入冰醋酸后，分离度发生改变，冰醋酸的浓度从0.1%增加至0.5%,出峰的形状和时间趋向于预期效果，比较甲醇—0.5%冰醋酸和乙腈—0.5%冰醋酸的色谱图可以看出，组分的出峰时间最为合适的是甲醇-0.5%冰醋酸流动相.

2.4.2 洗脱方式的选择 HPLC法中，存在等度洗脱和梯度洗脱两种方式，梯度洗脱是指改变盐的浓度增加洗脱杂质的效果，一般适用于成分复杂，杂峰出现时间晚的情况，等度洗脱的单一浓度对杂质的洗脱效果更佳，但操作也更为复杂.苦丁茶中所含化学成分复杂且极性相差较大，两者分开使用分离不完全，将两者结合会有更加的效果.如表1中所示，实验采取等梯度洗脱的方式结合，极大程度考虑出峰时间晚及分离状况不佳的现象.图5中能明显看出，此洗脱程序应用时出峰时间适中，分离效果好，色谱峰信息较为丰富.

2.4.3 检测波长的选择 图6所示为波长扫描范围200～400 nm特定波长下的色谱图，通过不同波长之间的色谱图进行相互对比发现，260 nm波长下苦丁茶样品出峰数目较多，色谱峰分离度和均衡性较好，因此，选择检测波长为260 nm.

2.4.4 流速的选择 如图7所示，在确定洗脱方式后，比较不同流速在260 nm波长检测下的出峰情况，不同流速下的色谱图差别较大，0.2 mL·min-1时的色谱图中主峰和杂峰的相互交错，主要物质的分离效果不佳，而流速为0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1时样品中出峰时间过快，且1.0 mL·min-1分离度不佳.对比流速0.4 mL·min-1和0.6 mL·min-1的色谱图，两者比较相似，峰形和分离效果都较好，其中流速为0.6 mL·min-1的出峰时间稍早些更为合适，因此选择流速0.6 mL·min-1最为恰当.

2.5 参照峰的选择

苦丁茶样品中化学成分众多，含有绿原酸等常见物质，因此量取标准品绿原酸溶液4 μL 按照上述选择的最优色谱条件进样分析，考察绿原酸作为对照样品的适宜性.如图8绿原酸溶液分析的HPLC色谱图，该图中色谱峰的出峰时间及响应值都良好，适合作为样品检测的参照峰.

图4 流动相的选择Fig.4 Investigation of mobile phases

表1 洗脱程序Tab.1 Elution program

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取S1批号的苦丁茶样品，按上述提取优化条件制成供试样液，采用已确定的色谱条件检测，整理连续5次进样检测的数据，计算得到RSD值.如表2所示，共有峰相对保留时间的RSD为0.014 2%～0.135 3%，相对峰面积的RSD为0.257 4%～3.960 9%，在此结果范围内，仪器精密度合格.

图5 洗脱程序色谱图Fig.5 Elution program chromatogram

图6 HPLC不同检测波长的考察结果Fig.6 Investigation of different detection wavelength

图7 HPLC流速的考察Fig.7 Investigation of flow rate

图8 绿原酸的HPLC色谱图Fig.8 HPLC diagram of chlorogenic acid

表2 精密度试验RSD结果Tab.2 Precision test RSD results %

2.6.2 稳定性试验 取S1批号的苦丁茶样品，按上述提取优化条件制成供试样液，按最优色谱条件检测，考察样品在0、2、4、6、12 h内的稳定性，计算得到RSD值，结果如表3所示.从表中可以看出，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.021 5%～0.139 1%，相对峰面积的RSD为0.542 6%～3.924 1%，数据结果显示该苦丁茶样品溶液在12 h内具有稳定性.

2.6.3 重复性试验 取S1批号的苦丁茶样品，按上述提取优化条件制成供试样液，平行制备5份，进行检测.如表4结果显示，共有峰相对保留时间的RSD为0.013 2%～0.133 2%，相对峰面积的RSD为0.642 3%～4.047 0%，样品溶液在该优化条件下检测重现性较好.

表3 稳定性试验RSD结果Tab.3 Stability test RSD results %

表4 重复性试验RSD结果Tab.4 RSD results of repeated tests %

2.7 建立指纹图谱与相似度评价

2.7.1 10批苦丁茶样品指纹图谱建立 指纹图谱的建立及研究结果可为后续苦丁茶药效物质基础研究奠定基础.按照前文中最优提取条件将各地区药房中得到的不同批次苦丁茶样品制备成供检测样液，总计10批样品溶液.按照最优色谱条件依次检测，得到来自不同药房10批苦丁茶的HPLC色谱图，如图9所示.图10是利用软件“中药指纹图谱相似度评价系统”处理后的对照HPLC指纹图谱，而此实验的完成，能初步对苦丁茶的主成分进行表征，是苦丁茶药物药效研究的重要环节.

图9 10批苦丁茶样品的HPLC图谱Fig.9 HPLC analysis of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.samples

图10 苦丁茶对照指纹图谱Fig.10 Reference fingerprint of Ilex latifolia Thunb.

表5中可以看出相对峰面积RSD最高达到39.031 0%，最低为15.683 6%，结果表明，各批次苦丁茶的组分含量之间存在较大差异，10批苦丁茶产地的种植条件，环境气候以及贮存方式都可能是产生此现象的原因.

表5 10批苦丁茶指纹图谱共有峰RSD结果Tab.5 RSD results were found in fingerprints of 10 batches of Ilex latifolia Thunb. %

2.7.2 相似度评价 表6中可知，软件数据处理时可直接匹配10批苦丁茶的指纹峰，与已有的共有模型测定相关性，最终数据为10批样品相似度均>0.9，符合中药指纹图谱技术要求.

表5、6的结果显示，10批苦丁茶的相对保留时间RSD值<1%，所含化学成分保持一致，相似度>0.9，符合中药指纹图谱技术要求，表明不同批次样品虽然存在各种影响组分含量差异的原因，但其基本比例还会保持一定水平，对实验过程中影响相对较小，建立苦丁茶HPLC指纹图谱能真实反映质与量的关系，帮助苦丁茶的药效物质基础研究及其质量控制提供科学依据.

表6 10批不同产地苦丁茶相似度Tab.6 Similarity of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.from different origins

3 结论

本实验在综合考虑苦丁茶样品的提取率和组分含量后，对供试样品制备过程中的提取方式、提取时间以及提取试剂等三个方面进行了优化.加热提取和超声提取的色谱图差异小，相似度高，但从操作简便的角度看，超声提取更具优势.在同种提取方式下，考察了不同提取溶剂对苦丁茶提取率高低，最终选择75%乙醇作为提取剂.确定提取方式和提取溶剂后，比较不同超声时间30 min、60 min、90 min、120 min的适宜性，结果显示，随着时间的增长提取率变化不大，且超声时间过长对苦丁茶的成分结构有破坏，因此选择30 min作为超声提取时间.HPLC能清晰分辨药物中的各类活性物质，分离条件的优化，在主成分分离和组分种类分析中具有重要作用，确定了流动相为甲醇—0.5%醋酸、等梯度洗脱方式、吸收波长为260 nm、流速为0.6 mL·min-1的最优色谱条件，通过对分离条件的优化，则会减少进样物质不必要的损耗，出峰效果上也能有很好的辅助作用.精密度、稳定性、重复性方法学实验，是一项保证实验数据缜密的程序性流程，很大程度上增加数据的严谨性.结果表明实验所用仪器的精密度良好，样品溶液12 h内保持较高稳定性，在优化的提取方式和检测条件下样品展现良好重复性.实验成功建立苦丁茶的指纹图谱，实现苦丁茶主物质初步探究，并在相应的软件中，对10批苦丁茶样品的共有峰进行评价，结果为10批样品相似度均>0.9，符合要求.