皮肤鳞状细胞癌Nrf2和Keap1的表达分析＊

李雪丽 许雪珠 兰建平 林妙春 王兴斌 郑雅男

鳞状细胞癌（SCCs）为皮肤常见恶性肿瘤之一，好发于曝光部位，特别是颜面部，有一定损容性，易复发，病因不明，可能与长期紫外线照射、电离辐射等有关。核因子E2相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）与体内抗氧化反应密切有关，且对紫外线有防护作用。Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白 1（Keleh-like associated protein 1，Keap1）通过胞质内泛素化方式负性调节Nrf2的表达。病理状态下，如氧化应激、亲电压力，Keap1作为一个分子传感器，通过化学修饰使Nrf2与之解离[1-2]，Nrf2被释放并快速转移到细胞核内，与谷胱甘肽、谷胱甘肽S-转移酶等氧化还原Ⅱ相代谢酶基因相关抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE）结合诱导下游基因表达，参与体内氧化应激调节，降低细胞体内外氧化损伤。氧化损伤如不能及时修复，细胞可能发生癌变。现已有大量研究表明Nrf2与肿瘤发生、发展、转移及肿瘤耐药机制密切相关[3-5]。然而国内外对皮肤癌（包括鳞状细胞癌）与Nrf2的关系研究较少，本文通过免疫组化技术分析Nrf2和Keap1蛋白在正常皮肤组织和皮肤鳞状细胞癌中阳性表达情况，以期探讨Nrf2在皮肤鳞状细胞中的发病机制，从而为皮肤癌生物靶向治疗提供理论依据，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

试验组标本来自2013年9月-2015年1月在笔者所在医院门诊手术切除人颜面部皮肤鳞状细胞癌组织，共15例，其中男9例，女6例，年龄56～81岁，平均（67.80±9.14）岁。纳入标准：确诊鳞状细胞癌并行手术治疗；既往未接受放化疗、免疫学治疗；标本留取完整并行病理学检查；留取标本可进行Nrf2及Keap-1免疫组化检查。排除标准：患者病历资料不完整；伴有其他部位恶性肿瘤；伴有免疫系统疾病。对照组标本来自同例患者癌旁组织，并经病理学确诊。本试验于2013年9月-2015年8月在福建医科大学附属闽东医院中心实验室完成。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂如下：Nrf2和Keap1一抗[艾博抗（Abcam）（上海）贸易有限公司]、免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）等；主要仪器有：上海精宏电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A型）、武汉俊杰生物组织摊烤片机（JK-5型）、德国Leica石蜡切片机辆（RM2245型）等。

1.3 方法

本研究采用随机对照试验设计。免疫组化试验：手术切除人颜面部病理学确诊鳞状细胞癌蜡块及癌旁组织蜡块，连续切片，厚度为5 μm，组织切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，自来水冲洗；石蜡切片脱蜡和水化后，自来水冲洗。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）水煮20 min进行组织抗原修复，PBS冲洗3次，3～5 min/次，除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl 3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，3 min/次，除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl非免疫山羊血清，室温下孵育10 min，直接甩去表层残余血清，每张切片加50 μl的第一抗体，室温下孵育60 min，PBS冲洗 3次，3～5 min/次，除去 PBS液，每张切片加 50 μl即用 型 MaxVisionTM（KIT-5910 MaxVisionTM HRP-Polymer antirabbit/mouse IHC Kit）试剂，室温下孵育 15 min，PBS 冲洗 3 次，3 min/次，除去PBS液，每张切片加100 μl新鲜配制的DAB显色液，作用5 min，显微镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明后再中性树胶封固。

1.4 观察指标及评价标准

Keap1蛋白主要表达于细胞核和细胞质、Nrf2蛋白阳性着色表达于细胞核，两种蛋白阳性染色呈黄色、棕黄色、褐色表达，阴性表达为淡蓝色或深蓝色的基础染色，无黄色、棕黄色、褐色表达。观察Nrf2和Keap1在鳞状细胞癌和正常组织中的阳性表达率。

1.5 统计学处理

应用SPSS 15.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Keap1及Nrf2蛋白阳性表达情况比较

试验组病例中皮肤鳞状细胞癌共15例，所有患者术前检查均未发现肿瘤转移，均经手术治疗，术后出现1例复发，其余在随访期间均无复发。免疫组化结果提示试验组Nrf2及Keap1蛋白均有7例为弱阳性，占46.67%，对照组均为阳性；试验组Keap1及Nrf2蛋白阳性表达率均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 两组Keap1及Nrf2蛋白阳性表达情况比较 例（%）

2.2 Keap1及Nrf2免疫组化结果分析

免疫组化结果：Keap1-对照组标本可见表皮中阳性表达，真皮中表达阴性（图1A、B、C）；而试验组即鳞状细胞癌标本中，低分化标本（1例）、中-低分化标本（2例）、中分化标本（2例）、高-中分化标本（3例）表皮、真皮中Keap1表达均为阴性（图1D、E、F），高分化标本（7例）表皮中表达部分为弱阳性，真皮中表达为阴性。Nrf2-对照组中表皮均为阳性表达，真皮表达阴性（图1G、H、I），而试验组即鳞状细胞癌标本中，高分化标本（7例）表皮中可见少量弱阳性表达，真皮表达阴性，除高分化标本以外，表皮、真皮中Nrf2表达均为阴性（图1J、K、L）。

图1 鳞状细胞癌组织及癌旁组织中Keap1和Nrf2免疫组化表达结果

3 讨论

根据本研究结果，笔者认为，与正常皮肤组织相比，Nrf2及Keap1在皮肤鳞状细胞癌中阳性低表达或无表达，提示其可能与皮肤鳞状细胞癌的发生有关，且肿瘤的分化程度也对其有一定的影响，高分化、恶性程度较低的肿瘤中可见Nrf2及Keap1弱阳性表达；分化程度低、恶性程度高的肿瘤中未见Nrf2及Keap1表达，说明Nrf2及Keap1表达下调与肿瘤的分化程度有关。

皮肤长期暴露于外界刺激（如紫外线、环境污染、毒素等）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和亲电压力，导致皮肤DNA和蛋白损伤，Nrf2可对抗这些细胞毒性作用，对疾病有化学保护作用。国内外许多研究表明Nrf2对肿瘤有抑制作用。比如说，Nrf2缺失小鼠更易发生致癌作用[6-7]，Nrf2丢失与癌症转移增加有关[8-9]。然而，新近研究表明Nrf2在恶性肿瘤（如胃癌、肺癌、脑胶质瘤等）细胞核中高表达并出现基因突变、丢失[10-13]。Nrf2通过上调ll相解毒酶、抗氧化蛋白等蛋白质的表达，从而改变体内的氧化还原状态。在正常情况下，Keap1与Nrf2结合导致Nrf2降解；在氧化应激状态下，Keap1蛋白不能泛素化降解Nrf2，Nrf2积累进入细胞核，与ARE结合，启动一系列抗氧化基因和二相解毒酶基因的表达使得DNA、生物大分子免受损伤[14-15]。

当细胞受到氧化应激及高亲电压力时，Nrf2从细胞质解离，可通过Keap1依赖途径及非Keap1依赖途径进入细胞核内，但本文Keap1核内表达阴性，说明Nrf2可能是通过非Keap1依赖途径进入细胞核内。尽管Nrf2在氧化应激方面有卓越作用，但亦可通过影响细胞内氧化还原系统平衡来参与细胞的增殖和分化，而染色体分析表明参与细胞增殖和分化的基因和氧化应激的基因并非完全一致，Nrf2多功能性提示Nrf2是一种诱导型的转录因子[16]。

本研究免疫组化结果示Nrf2在皮肤鳞状细胞癌阳性表达减少或无表达，与Chang等[17]研究结果一致，与Stacy等[18]研究中头颈部鳞状细胞癌中91.5%伴有Nrf2高表达的结果相反。在本组病例中，分化程度高的鳞状细胞癌标本中见到弱阳性表达的Nrf2及Keap1，而到高-中分化及其他分化程度低的标本中均未见阳性表达，考虑可能与皮肤长期紫外线等外界刺激、ROS聚集、亲电压力增加，导致Nrf2化学保护功能异常，同时影响负性调节因子Keap1过度降解Nrf2，导致Nrf2低表达或无表达，使其失去对肿瘤的抑制作用，且肿瘤的分化程度也对其有一定的影响，恶性程度高的肿瘤中未见Nrf2表达，说明Nrf2表达下调与肿瘤的发生有关。但具体机制仍未十分清晰，需要更多研究进一步明确Nrf2及Keap1在皮肤恶性肿瘤中的作用机制。尽管如此，Nrf2及Keap1在肿瘤靶向治疗的研究中仍具有广阔前景。