大肠癌患者大肠埃希菌、双歧杆菌水平检测及其临床意义

李春鸿 林养 邓丽花 梁汝忠

大肠癌是消化系统常见恶性肿瘤的一种，据报道全世界新诊断的大肠癌病例数接近每年100万，已跃居消化系统恶性肿瘤的第3位，仅次于胃癌、食管癌[1]。大肠癌起病隐匿，早期多无症状，多数患者出现明显症状就诊时已属中晚期，5年生存率约为12%[2]。早发现、早治疗为改善大肠癌患者临床预后的关键因素[3]。目前临床采用的检测技术如大便潜血试验、气钡灌肠、电子结肠镜等，但存在精确性低、费用高、侵袭性大等缺陷，甚至还可能引起如肠出血、穿孔等并发症，极大降低了患者的依从性[4]。人体消化道定居着各种肠道菌群，其在物质代谢、营养合成、免疫功能等方面起着重要作用。肠道菌群也是引起消化系统炎症的主要因素之一，肠道菌群的改变及其代谢产物对大肠癌的发生发展有一定影响[5-6]。本研究采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）测定大肠癌患者体内的大肠埃希菌、双歧杆菌水平，并分析大肠埃希菌、双歧杆菌与大肠癌发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究筛选2018年12月-2019年12月本院就诊的60例大肠癌患者作为大肠癌组，纳入标准：（1）符合文献[7]《现代肿瘤学》大肠癌诊断标准，且通过肠镜和术后病理检查确诊；大肠癌的临床分期、分化程度、淋巴浸润符合文献[8]2002年国际抗癌联盟（UICC）标准；（2）年龄20～75岁的初诊者；（3）生存期预期超过3个月；（4）无结直肠手术史；（5）入院前未经抗肿瘤相关治疗；（6）无特殊饮食习惯及近2周内未曾服用影响肠道菌群药物。排除标准：（1）存在其他原发性肿瘤；（2）粪便样本污染；（3）合并心、肝、肾、血液系统等疾病；（4）伴溃疡性结肠炎、肠系膜炎症及克罗恩病等消化性疾病；（5）长期腹泻。选取同期在本院体检中心体检且结果均为健康者50例作为对照组，纳入标准：（1）年龄40～75岁；（2）无消化道疾病史。排除标准：（1）病历资料不完整；（2）近2周内反复腹泻。大肠癌组男37例，女23例；年龄40～71岁，平均（62.56±9.14）岁；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期16例，Ⅳ期6例；肿瘤位置：结肠31例，直肠29例；分化程度：高分化21例，中低分化39例。对照组男35例，女15例；年龄43～70岁，平均（61.98±9.93）岁。两组性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 大肠埃希菌、双歧杆菌的检测

收集两组病例的新鲜大便，以天平称取中段大便，每份5 g，存放于无菌离心管中，置于-80 ℃冰备用。设计大肠埃希菌、双歧杆菌的引物，并以局部序列比对基本检索工具在线核实其特异性，在上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取0.5 g粪便样本加入缓冲液，充分混匀，置于离心管中，3 000 r/min离心5 min取上清液，收集沉淀，使用酚/氯仿抽提纯化法提取DNA，以核酸蛋白检测仪检测DNA浓度，琼脂糖凝胶行电泳，观察DNA片段的大小和完整性。实时荧光定量PCR Master Mix（2×）10 μl，上游引物（10 μmol/L）1.0 μl，下游引物（10 μmol/L）1.0 μl，cDNA 模 板（300 ng/μl）2.0 μl， 加 焦碳酸二乙酯补足为20 μl。反应后粪便标本所含细菌拷贝数由PCR仪分析其循环阈值（Ct值），并与标准曲线比较，获得样本菌群定量结果。制作标准曲线。取PCR反应产物与溴酚蓝混匀，上样，行琼脂糖凝胶电泳，摄像、纯化，核酸蛋白检测仪检测目标基因浓度，计算基因拷贝数，并将其稀释为（10～109）copies/ml，作为标准品；取纯化产物20 μl及粪肠球菌上、下游引物进行测序，对纯化产物行荧光定量PCR，根读取荧光数据，由系统软件自动分析Ct值。

1.3 统计学处理

本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，直线相关用Pearson相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大肠埃希菌、双歧杆菌水平比较

大肠癌组大肠埃希菌水平明显高于对照组，双歧杆菌明显低于对照组（P＜0.01），见表1。

表1 两组大肠埃希菌、双歧杆菌水平比较 [copies/g，（±s）]

表1 两组大肠埃希菌、双歧杆菌水平比较 [copies/g，（±s）]

组别 大肠埃希菌 双歧杆菌对照组（n=5 0） 4.3 7±0.6 5 9.3 0±1.4 7大肠癌组（n=6 0） 6.6 8±0.9 3 4.4 7±0.6 2 t值 1 3.9 3 8 1 3.0 9 9 P值 0.0 0 0 0.0 0 1

2.2 大肠埃希菌、双歧杆菌与大肠癌临床病理特征的关系

大肠癌患者年龄、性别、肿瘤位置因素的大肠埃希菌、双歧杆菌水平差异无统计学意义（P＞0.05），分化程度、TNM分期因素的大肠埃希菌、双歧杆菌水平差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

2.3 大肠癌患者大肠埃希菌、双歧杆菌与临床病理特征的相关性

经Pearson相关性分析，大肠癌患者大肠埃希菌、双歧杆菌与分化程度和TNM分期呈明显相关（P＜0.01），但与年龄、性别、肿瘤位置无相关性（P＞0.05），见表3。

表2 大肠埃希菌、双歧杆菌与大肠癌临床病理特征的关系 [copies/g，（±s）]

表2 大肠埃希菌、双歧杆菌与大肠癌临床病理特征的关系 [copies/g，（±s）]

水平 t值 P值 水平 t值 P值年龄 ＜60岁（n=38） 6.51±0.99 0.103 ＞0.05 4.33±0.81 0.931 ＞0.05≥60岁（n=22） 6.85±1.25 4.63±0.77性别 男（n=37） 6.55±1.11 0.081 ＞0.05 4.29±0.89 0.962 ＞0.05女（n=23） 6.81±1.37 4.67±0.93分化程度 高（n=21） 3.93±0.55 14.401 ＜0.01 5.61±0.73 9.005 ＜0.01中低（n=39） 9.43±1.47 3.33±0.51肿瘤位置 结肠（n=31） 6.90±1.28 0.049 ＞0.05 4.21±0.68 0.994 ＞0.05直肠（n=29） 6.46±1.21 4.75±0.80 TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期（n=38） 3.46±0.51 12.133 ＜0.01 5.77±0.81 9.215 ＜0.01Ⅲ、Ⅳ期（n=22） 9.19±1.78 3.15±0.53因素 大肠埃希菌 双歧杆菌

表3 大肠癌患者大肠埃希菌、双歧杆菌与临床病理特征的相关性分析

3 讨论

肠道菌群与大肠癌发生发展的相关性已获得医学界的共识。生理状态下肠道菌群保持着一种动态平衡，有助于正常肠道屏障功能的维持，对病原体产生免疫反应[9]。肠道菌群的平衡一旦被打破，出现肠道菌群失调，与许多疾病如肥胖、炎症性肠病及大肠癌等相关[10]。特殊的肠道菌群可产生引起大肠癌风险的毒素，其能够激活炎症信号通路，导致DNA损害，最终引起肿瘤发生，如肠道菌群通过其代谢产物次级胆汁酸，在大肠癌的发生中起到重要作用[11]。

大肠埃希氏菌又被称为大肠杆菌，主要为条件致病菌，可诱导肠道慢性炎症、内毒素产生，参与肿瘤的发生发展过程[12]。目前已知致病性大肠杆菌能合成毒素cyclomodulins、细胞毒性坏死因子、循环抑制因子及大肠杆菌毒素[13]。cyclomodulins具有遗传毒性和调节细胞周期的作用，能够调节细胞增殖、分化和、凋亡[13]。大肠杆菌毒素具有由大肠杆菌多聚乙酰合成酶岛所编码多聚乙酰合成酶，此酶通过诱导人DNA双链断裂及染色体不稳定，协同促进大肠癌发生[13]。研究也表明具有多聚乙酰合成酶岛的大肠杆菌在大肠癌患者中更常见，支持了致病性大肠杆菌在大肠癌发生发展过程中的促进作用[14]。本研究结果显示，大肠癌组大肠埃希菌水平明显高于对照组；大肠埃希菌与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤位置无关，而与分化程度、TNM分期有关；经Pearson相关性分析，大肠埃希菌与大肠癌分化程度和TNM分期呈正相关，但与年龄、性别、肿瘤位置无相关性。文献[15]报道大肠癌组患者大肠杆菌水平均明显高于健康人群，大肠杆菌与大肠癌的TNM分期呈显著性正相关。说明大肠埃希菌状况与大肠癌的发生发展存在一定的相关性。

双歧杆菌为人体肠道的益生菌，可合成多种维生素，有助于肠道的蠕动，增强机体的免疫功能[16]。临床治疗研究显示双歧杆菌可缓解晚期大肠癌患者使用伊立替康化疗所引起的腹泻发生，改善患者生活质量[17]。本研究结果显示，大肠癌组双歧杆菌明显低于对照组，双歧杆菌与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤位置无关，而与分化程度、TNM分期有关；经Pearson相关性分析，双歧杆菌与大肠癌的分化程度和TNM分期呈正呈明显相关，但与年龄、性别、肿瘤位置无相关性。大量研究均证实了大肠癌组患者大肠杆菌水平均明显高于健康人群，大肠杆菌与大肠癌的TNM分期呈显著性正相关[15，18]。表明双歧杆菌状况与大肠癌的发生、发展密切相关。

综上所述，大肠癌患者体内的大肠埃希菌明显升高及双歧杆菌显著降低，且与大肠癌分化程度和临床分期呈明显相关性。但本研究所纳入的样本量较小，且未对肠道菌群失调对大肠癌发生、发展的作用机制进行探讨，值得进一步研究。