制狗脊促进大鼠骨质疏松性骨折愈合的实验研究

罗 程 朱利民 张元斌 孙 奇 胡柏松 鲍荣华 陈学强

骨质疏松性骨折是指因骨量丢失后骨密度降低、骨组织微细结构被破坏而引起的一种脆性骨折，是骨伤科临床多发病与常见病[1]。该类骨折损伤重且复杂，骨折不稳定，多发老年女性等骨质疏松人群，常合并多种内科疾病等。临床上，因处理不合理不及时，存在较高骨折延迟愈合、骨折不愈合发生率，甚至导致残疾与死亡[2]。鉴于这类骨折的特殊性，在合理处理骨折的同时还需结合进行抗骨质疏松治疗。研究发现，中药促进骨折愈合的同时还可改善骨质疏松[3-4]。活血化瘀，补肾益精是中医治疗骨折的原则，制狗脊为临床上治疗骨质疏松症常用补肾中药。实验研究发现，狗脊可抑制破骨细胞活性，促进成骨，具有抗骨质疏松作用[5]。本研究拟通过骨密度检测、Micro-CT 等方法观察制狗脊对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响，并通过检测钙、磷、血清TGF-β1、IL-1β 水平初探其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物及制备 取制狗脊5kg（浙江中医药大学药厂）10 倍纯水浸泡1h，煎煮1h，提取2 次，过滤后药液旋蒸仪浓缩至浓度104.2g/L 备用[6]。七厘散胶囊（华颐药业有限公司，规格：0.5g/粒，国药准字Z10940041），脱胶囊后用生理盐水稀释配制成浓度0.3/mL 的混悬液备用。七厘散胶囊给药剂量依人与动物等效剂量换算得出[7]。

1.2 动 物 32 只SPF 级SD 雌性大鼠，体质量200～250g，生产许可：SCXK（沪）2013-0016；使用许可：SYXK（浙）2013-0184，于浙江中医药大学动物实验中心订购，且饲养于标准实验室条件下12h 昼12h夜循环，温度恒定20℃，湿度48%，采用标准的啮齿类动物饲料喂养。实验动物处置符合浙江中医药大学实验动物伦理学标准。

1.3 仪器及试剂 PVP 碘（杭州朗索医用消毒剂有限公司，批号20160720）；转化生长因子-β1（TGFβ1）试剂盒（批号20160722）和白介素-1β（IL-1β）试剂盒（批号20160715）均购自艾博抗上海生物有限公司、Micro-CT、骨密度扫描仪（BRUKER MICROCT N.V，型号Skyscan1176）。

2 实验方法

2.1 大鼠骨质疏松模型 适应性饲养1 周后，32 只SD 大鼠采用随机数字表分成对照组与观察组，各组按2、6 周时间点再分为两个亚组，每组8 只。1%戊巴比妥钠麻醉（4mL/kg）后备皮、消毒、铺巾后摘除双侧卵巢，制备去卵巢骨质疏松模型[8]。备皮、消毒、铺巾、切开，行股骨中段横行骨折造模[5]，并以1mm 克氏针固定，消毒缝合切口皮肤。

2.2 骨折模型与干预 骨质疏松造模6 周后经骨密度检测确定造模成功，再经备皮、常规消毒铺巾后切皮行胫骨骨折造模，骨折造模完成后再予克氏针固定[9]，检查稳定性后予缝合。

2.3 药物干预与样本处理 骨折造模后均需行X线检测，骨折造模术后24h 开始干预，观察组大鼠予制狗脊水提物灌胃（浓度104.2g/L，剂量10mL/kg，1天1 次）[6]，对照组大鼠予七厘散胶囊药液灌胃（浓度0.3g/mL，剂量17mL/kg，1 天1 次），干预2、6 周后，两组大鼠麻醉后抽取主动脉血经静置、离心后制备血清于-20℃冰箱备用，并于骨折部位上下关节处离断，小心剔除肌肉组织（注意保护骨折处骨痂），骨痂上下0.5cm 再次修裁组织，置于固定液72h 待后续处理。

2.4 观察指标

2.4.1 骨密度检测 骨质疏松造模后6 周，所有大鼠均行骨密度检测。干预2、6 周后大鼠收样固定72h后均行骨密度检测。

2.4.2 Micro-CT 检测 Micro-CT 扫描完成后，选取骨折端周围400 层图像进行重建分析。观察指标：骨体积分数BV/TV、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、结构模型指数（structure model index，SMI）[10]。

2.4.3 血清检测 解冻各组大鼠血清，分别检测血清TGF-β1、IL-1β 水平与钙、磷水平，各试剂常温后经加样、育温、甩干等步骤后经酶标仪检测后记录数据，具体操作步骤参照各试剂盒说明书。

2.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（） 表示，组间行独立样本t 检验，检验水准为P<0.05。

3 实验结果

3.1 两组大鼠胫骨中段骨密度比较 与对照组比较，观察组大鼠2、6 周时胫骨中段骨密度显著增加（P 均<0.05），见表1。

表1 两组大鼠胫骨中段骨密度比较（g/cm2，）

表1 两组大鼠胫骨中段骨密度比较（g/cm2，）

注：观察组予制狗脊水提物灌胃；对照组予七厘散胶囊药液灌胃；与对照组比较，aP＜0.05

3.2 截面图 选取各组各时间点矢状、冠状截面图，依图可见两组大鼠骨折端骨痂逐渐增多，骨折逐渐趋于愈合。干预2 周后可见观察组大鼠骨痂量、密度及连续性均明显优于对照组。干预6 周后两组间差异明显，虽然观察组骨痂量少于对照组，但其骨痂爬过骨折线，断端骨折线不明显，骨痂塑形。见图2-3。

图2 胫骨中段矢状截面图

图3 胫骨中段冠状截面图

3.3 三维重建 两组各时间点胫骨中段骨折端骨痂三维重建（见图4）。两组骨质密度、小梁形态逐渐变强变粗，骨折后2 周观察组骨痂骨量多于对照组；而骨折6 周后对照组骨痂网状、板状小梁参半，反观观察组骨痂密实，小梁规则呈板状，骨折线消失，小梁质量较对照组更优。

表2 各组Micro-CT 检测参数比较（）

表2 各组Micro-CT 检测参数比较（）

注：观察组予制狗脊水提物灌胃；对照组予七厘散胶囊药液灌胃；BV/TV 为相对骨体积；Tb.N 为骨小梁数量；Tb.Th 为骨小梁厚度；SMI 为结构模型指数；与对照组同期比较，aP＜0.05

表3 各组大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及钙、磷水平比较（）

表3 各组大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及钙、磷水平比较（）

注：观察组予制狗脊水提物灌胃；对照组予七厘散胶囊药液灌胃；TGF-β1 为转化生长因子-β1；IL-1β 为白介素-1β；与对照组同期比较，aP＜0.05

图4 骨折端骨痂三维重建

3.4 Micro-CT 参数 Micro-CT 扫描参数[6]显示，干预2 周后观察组Tb.N、SMI 参数均优于对照组（P＜0.05），两组BV/TV 与Tb.Th 参数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。干预6 周后，观察组BV/TV、Tb.N、Tb.Th、SMI 参数均优于对照组（P 均＜0.05）。见表2。

3.5 两组大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及钙、磷水平比较 观察组干预后2、6 周TGF-β1 水平均高于对照组（P 均＜0.05），IL-1β 水平低于对照组（P 均＜0.05）。干预后2 周，观察组大鼠血清钙、磷水平明显高于对照组（P 均＜0.05），两组大鼠干预后6 周血清钙、磷水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

4 讨论

骨质疏松性骨折是发生于骨强度降低、骨组织微结构破坏、骨骼脆性增大全身代谢疾病基础上的骨折[1]，所以其临床处理既要复位骨折又要抗骨质疏松治疗，骨折复位可通过手法整复、手术等方法实现，而骨质疏松症的治疗目前多依赖破骨细胞骨吸收的抑制，虽然骨折愈合需要大量成骨，但也离不开破骨细胞的塑形作用。

制狗脊作为常用补肾中药，其性温味苦、甘，具有补肝肾、强腰膝、祛风湿等功效，现代药理学研究发现其具有促成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性的作用。此外，狗脊还被发现具有抑菌抗炎、抑制血小板聚集、镇痛等作用[5]。本实验中，观察组干预2、6 周后骨密度检测结果均优于对照组，而骨密度是评估骨量的有效指标，BV/TV 参数可直接反映骨量多少且更敏感、可靠。本研究中，在干预6 周后观察组BV/TV 参数高于对照组（P＜0.05），提示制狗脊提取物可增加骨质疏松性骨折骨痂骨量。Tb.Th、Tb.N 为骨痂骨小梁厚度与数量，与骨强度密切相关。本研究中观察组Tb.N、Tb.Th 指标均优于对照组（P＜0.05），这提示观察组大鼠骨痂强度更高。SMI 为结构模型指数，反映的是骨痂生物力学性质，本研究中观察组干预2、6 周后SMI 均优于对照组，这进一步印证了制狗脊改善骨质丢失、增强骨强度的作用。制狗脊作用机制可能与其提取物可有效抑制破骨细胞活性，降低骨钙素、脱氧吡啶啉水平，抑制骨吸收有关；另一方面，还可能与制狗脊可促进成骨细胞增殖及上调ALP 活性成分有关[11]。

钙磷是成骨过程中不可或缺的组分，在干预后2、6 周观察组血清钙、磷水平均高于对照组，两组在两观察时间点TGF-β1 水平也存在显著差异，提示制狗脊可有效上调TGF-β1 水平，而TGF-β1 水平对成骨分化具有至关重要的作用，可有效促进其增殖、分化[12]，进而促进骨折愈合，观察组大鼠骨量更优可能与其有关。另外，对照组两时间点IL-1β 水平均高于观察组，而IL-1β 可通过NF-κB 等信号通路参与破骨细胞活性调控[13]。一定水平的IL-1β 有利于骨痂重塑，然而对于骨质疏松性骨折患者而言，这可能引发成骨-破骨体系中的破骨优势。因此，可以认为制狗脊一方面可有效上调TGF-β1 水平从而促进成骨分化，另一方面还可抑制IL-1β 分泌而部分抑制破骨优势，共同促进骨折愈合。

综上所述，制狗脊提取物可增加骨质疏松性骨折骨痂骨量，并增强其强度，促进骨痂生成与塑形，进而促进骨质疏松性骨折愈合，且其机制可能与其对血清IL-1β、TGF-β1 水平的调节有关。