盐酸小檗碱对恶性黑素瘤细胞A375增殖、凋亡和迁移的影响

郑增光 王鹏雁

恶性黑色素瘤是一种恶性程度极高的皮肤/黏膜恶性肿瘤，常起病隐匿，不易引起重视，确诊时多有淋巴结或远处转移，手术后放化疗不仅毒副作用大，且五年生存率仅16%[1-2]。小檗碱（berberine hydrochloride）是中药黄连的主要活性成分之一，具有抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂及抗抑郁等广泛的生物学作用[3-5]。体内、外实验表明，小檗碱具有较好的抗肿瘤作用[6-7]。本研究以TLR4 为靶点，观察盐酸小檗碱对黑色素瘤A375 细胞增殖、凋亡和迁移的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 人黑素瘤A375 细胞株（上海中科院细胞库，批号SCCP-533）。

1.2 药 物 盐酸小檗碱（selleck 生物科技公司，批号S904601，分子量336.36），青霉素-链霉素溶液（美国Gibco 公司，批号15070063）。

1.3 试剂及仪器 CCK8 试剂盒（日本同仁生物公司，批号010417170406）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号10099141）、DMEM 细胞培养基（美国Gibco公司，批号1801040206）；Transwell 迁移室（德国Greiner 公司，批号DM-0079）；膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin.V/PI）凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号6301518）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号IK5013）、RNA 反转录试剂盒及PCR 实时荧光定量试剂盒（日本Takara 公司，批号15596026）；抗体TLR4（美国Cell signling 公司，批号14358）和βactin（美国Cell signling 公司，批号4970）；HRP 偶联的二抗（美国Cell signling 公司，批号CS1123）；流式细胞仪（美国BD 公司）；荧光定量PCR 仪（Thermo公司）；GBOXHR 型全自动图像分析仪（基因有限公司）。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：TLR4-F：5'-CAGAAGCTGGTGGCTGTG -3'；TLR4-R：5'-ATGTAGAACCCGCAAGTC-3'；β-actin-F：5'-AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCA-3'；β-actin-R：5'-GGCGGGCACGTTGAAGGTCT-3'。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将A375 细胞株选为研究对象，用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素的DMEM 培养基，在5%CO2，37℃恒温箱内培养，待细胞长至80%～90%时按1∶2～1∶4 的密度传代，每2～3 天传代1 次，取其对数生长期用于实验。其中空白对照组细胞仅接受10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。而低、中、高剂量组细胞培养液中加入盐酸小檗碱，分别调整药物浓度为40、80、120μmol/L。

2.2 CCK-8 实验 制备细胞悬液，将计数细胞接种到96 孔板中，待测细胞调密度至铺满孔底70%左右，设置3 个重复。将96 孔平底板置于5%CO2，37℃培养箱中培养24h，加入10μL CCK-8，继续培养1～4h，形成Formazan。使用酶标仪在用450nm 波长检测吸光度（A）值。细胞存活率（%）=（A 实验组-A 凋零组）/（A 空白对照组-A 凋零组）×100%。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期A375 细胞，按以上分组处理24h，用胰酶消化后用预冷的PBS 洗涤；再用去离子水按1:3 稀释结合缓冲液，1X 结合缓冲液重新悬浮细胞；取100μL 的细胞悬液于5mL 流式管中，加入5μL Annexin V/FITC 混匀后于室温避光孵育5min；然后再加入10μL 20μg/mL 碘化丙锭溶液（PI），并加400μL 的PBS，立刻进行流式检测，记录各组细胞凋亡数据并分析。

2.4 Transwell 法检测细胞迁移能力 将300μL 无血清培养基加入到小室上层，在其下层加入800μL培养基，37℃细胞培养箱静置2h，将饥饿处理24h 的细胞进行计数，用无血清的培养基稀释细胞密度为1×105/mL。去除活化时所用培养基，分别在小室下层加入800μL 10% FBS 的培养液，而小室的上层则加入300μL 细胞悬液。在37℃培养箱中培养细胞24h后，使用4%甲醇对细胞进行固定20min，然后进行结晶紫染色。显微镜下拍照（40×），随机选取3～5 个以上视野计数。

2.5 RT-PCR 检测A375 TLR4 mRNA 表达水平取A375 细胞接种于6cm 的培养皿中，给予盐酸小檗碱干预24h 后，按照RNA 试剂盒说明书操作，提取RNA。检测其完整性，并将其置于-80℃低温冰箱保存，用于下一步逆转录。按逆转录试剂盒说明书操作。逆转录反应完成后，取5μL PCR 产物和5μL PCR marker 进行琼脂糖电泳。电泳结束后，采用GBOXHR型全自动图像分析仪对电泳结果进行分析。

2.6 Western blot 检测A375 TLR4 蛋白表达 取对数期生长的A375 细胞培养24h，加入相应浓度盐酸小檗碱，继续培养48h，使用细胞裂解液裂解细胞，然后离心，吸取上清。用二喹啉甲酸（BCA）法检测细胞蛋白浓度。在十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上每组取20μg 蛋白上样，200V 恒压电泳至溴酚蓝迁移至分离胶下缘时，时间大约为40min，关掉电源，停止电泳。然后经过转膜/封闭，再依此加入TLR4 一抗，孵育过夜，洗膜，使用二抗孵育2h（Abeam 公司），化学光敏模式曝光显影。照片以TIFF 格式导出后在Image J软件下分析各条带光密度，计算TLR4 蛋白相对表达量。

表1 不同浓度盐酸小檗碱对A375 细胞存活率、凋亡率及细胞迁移力的影响（）

表1 不同浓度盐酸小檗碱对A375 细胞存活率、凋亡率及细胞迁移力的影响（）

注：空白对照组给予盐酸小檗碱0μmol/L；低剂量组给予盐酸小檗碱40μmol/L；中剂量组给予盐酸小檗碱80μmol/L；高剂量组给予盐酸小檗碱120μmol/L；与空白对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05

2.7 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析，计量资料以均值±标准差（） 表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 盐酸小檗碱对A375 细胞增殖存活率的影响各组细胞培养24h 后，空白对照组与盐酸小檗碱低、中、高剂量组差异有统计学意义（F=298.778，P<0.01）；细胞存活率随盐酸小檗碱浓度的增加而降低，低剂量组存活率显著低于空白对照组（P<0.05），中剂量组显著低于空白对照组及低剂量组（P 均<0.05），高剂量组显著低于空白对照组、低、中剂量组（P 均<0.05），见表1。

3.2 盐酸小檗碱对A375 细胞凋亡率的影响 AnnexinV/PI 双染法结果显示，空白对照组A375 细胞凋亡率与盐酸小檗碱低、中、高剂量组间差异有统计学意义（F=101.764，P<0.01）；细胞凋亡率随盐酸小檗碱浓度的增加而升高，低剂量组凋亡率显著高于空白对照组（P<0.05），中剂量组显著高于空白对照组及低剂量组（P 均<0.05），高剂量组显著高于空白对照组及低、中剂量组（P 均<0.05），见表1。

3.3 盐酸小檗碱对A375 细胞迁移力的影响 空白对照组与盐酸小檗碱低、中、高剂量组差异有统计学意义（F=510.805，P<0.01）；穿膜数随盐酸小檗碱浓度的增加而降低，低剂量组穿膜数显著低于空白对照组（P<0.05），中剂量组显著低于空白对照组及低剂量组（P 均<0.05），高剂量组显著低于空白对照组和低、中剂量组（P 均<0.05），见表1。

3.4 盐酸小檗碱对A375 细胞TLR4 mRNA 及蛋白表达的影响 空白对照组与盐酸小檗碱低、中、高剂量组TLR4 mRNA 及蛋白表达差异有统计学意义（F=428.200、2590.195，P 均<0.01）；TLR4 mRNA 及蛋白表达随盐酸小檗碱浓度的增加而逐渐降低，低剂量组显著低于空白对照组（P<0.05），中剂量组显著低于空白对照组及低剂量组（P 均<0.05），高剂量组显著低于空白对照组和低、中剂量组（P 均<0.05），见表2、图1。

表2 不同浓度盐酸小檗碱对A375 细胞TLR4 mRNA及蛋白表达（）

表2 不同浓度盐酸小檗碱对A375 细胞TLR4 mRNA及蛋白表达（）

注：空白对照组给予盐酸小檗碱0μmol/L；低剂量组给予盐酸小檗碱40μmol/L；中剂量组给予盐酸小檗碱80μmol/L；高剂量组给予盐酸小檗碱120μmol/L；TLR4 为Toll 样受体-4；β-actin mRNA 为内参基因；β-actin 蛋白为内参蛋白；与空白对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05

图1 不同浓度盐酸小檗碱作用后A375 细胞TLR4 蛋白表达

4 讨论

盐酸小檗碱作为抗菌消炎药在临床应用多年，近年发现盐酸小檗碱对多种类型实体肿瘤具有显著抗癌活性，如肝癌、宫颈癌、肺癌等[8-10]。有关盐酸小檗碱在恶性黑色素瘤的作用相关报道较少[11]，对其增殖凋亡、迁移的影响及调节机制尚不明确。本研究结果显示，3 种不同浓度盐酸小檗碱实验组对恶性黑色素瘤细胞株A375 的增殖具有显著的抑制作用，且随着药物浓度的增加，A375 细胞的细胞存活率逐渐下降（P<0.05），具有剂量依赖关系，由此推断盐酸小檗碱可以在体外有效抑制A375 细胞的增殖，且浓度越高，细胞存活率越低；流式细胞仪检测发现：随药物浓度的增加，A375 细胞的凋亡率逐渐升高（P<0.05），呈现剂量依赖关系。恶性黑色素瘤的治疗难点在于容易复发和远处转移，本研究通过Transwell 迁移实验进一步发现，盐酸小檗碱对A375 细胞株的迁移能力具有显著的抑制作用，且随着浓度的增加，细胞株的迁移能力逐渐下降（P<0.05）。

Toll 样受体（Toll like receptors，TLRs）是一类天然免疫受体，是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁。TLR4 是第一个被发现的哺乳动物TLR，属于细胞膜I 型跨膜糖蛋白受体，不但识别外源性的病原体（如LPS），还可识别内源性物质及其降解产物[12]。研究表明，TLR4 可在多种肿瘤细胞表达[10，13]，通过配体（LPS）的激活释放肿瘤生长因子和细胞生长因子形成肿瘤生长微环境，促进肿瘤的发展，逃避肿瘤的免疫反应[9，13]。TLR4 的激活可促进下游NF-κB 的磷酸化活化，从而激活释放肿瘤生长因子和细胞生长因子如IL-10、TNF-α 等[9，13]，参与调节肿瘤微环境。

本研究通过RT-PCR 及Western blot 实验发现，盐酸小檗碱可以有效抑制黑素瘤A375 细胞TLR4 mRNA 及蛋白表达。并且盐酸小檗碱对TLR4 mRNA及蛋白表达量的影响作用会随着药物浓度的升高而显著降低（P<0.05）。由此推断盐酸小檗碱可能通过阻断TLR4 信号通路影响肿瘤生长免疫微环境而发挥抗肿瘤作用；但其确切信号途径及其对下游肿瘤生长因子及细胞因子的影响尚需进一步研究。

综上所述，盐酸小檗碱可以促进黑素瘤A375 细胞凋亡，抑制A375 细胞的增殖和迁移能力，且这种作用具有剂量依赖关系。同时其抗肿瘤机制可能与抑制TLR4 信号通路有关。