血清lncRNA NEAT1和外周血T细胞亚群水平对宫颈癌组织分化程度和淋巴结转移的预测价值

翁艳洁 熊敏 叶双梅 郝星 任武 白剑

近年来，我国宫颈癌患者逐年递增，呈年轻化趋势，给医疗和个体带来了极大的负担[1]。宫颈癌发病机制相对复杂，高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)持续感染是宫颈癌发生的主要诱因[2]。HPV感染导致机体免疫系统监视清除障碍，即机体对同一种类型的高危HPV清除失败并长期持续感染会导致宫颈癌的发生、发展。外周血T淋巴细胞数量在相当大程度上决定体内细胞免疫功能水平，临床上可以检测T细胞亚群的比例来反应机体的免疫状态[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类参与肿瘤细胞内多种信号过程的RNA分子，其在人血清中丰富且稳定[4]，核富集转录体1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)是lncRNA的一种。研究发现，lncRNA NEAT1参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[5]，有可能成为某些恶性肿瘤的特异性生物标志物和潜在的治疗靶点。目前宫颈癌综合治疗后主要靠影像学评估预后情况，尚无明确的血清学检测手段来预测预后。组织分化程度和是否有淋巴转移是影响宫颈癌术后化疗及预后的重要因素，lncRNA NEAT1在宫颈癌患者体内表达水平与组织分化程度及淋巴转移的关系仍不清楚。因此，探讨宫颈癌患者体内lncRNA NEAT1表达水平及T细胞的数量及亚群比例，有助于为宫颈癌的早期诊断及评估预后提供实验依据。

对象与方法

一、一般资料

选取2017年1月至2019年10月华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科收治的172例宫颈癌患者为研究对象，所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①初诊，符合宫颈癌诊断标准[6]；②国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期Ⅰ～Ⅲ期[7]；③既往未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和随访资料完整；⑤手术治疗6个月后确定无肿瘤复发。排除标准：①精神异常或不能配合本研究的患者；②患者因患宫颈癌及相关疾病已进行手术的患者；③基础疾病病情严重，无法承受手术的患者；④患有其他生殖道疾病的患者。172例患者年龄28～64岁，平均(47.25±7.01)岁；身体质量指数(body mass index,BMI)18～26 kg/m2，平均(22.36±3.41)kg/m2；肿瘤直径：<4 cm 115例，≥4 cm 57例；FIGO分期：Ⅰ期82例，Ⅱ期65例，Ⅲ期25例；肌层浸润深度：浅肌层75例，深肌层97例；病理类型：鳞癌90例，腺癌82例。本研究经同济医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

二、研究方法

所有患者术前均抽取晨起空腹静脉血，进行以下检测：①取外周静脉血4 ml，乙二胺四乙酸二钾抗凝后使用 FACSCantoⅡ型流式细胞仪(贝克曼库尔特，中国)检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+T细胞和调节性T细胞(Treg细胞)比例。②取静脉血10 ml，离心后分离上层血清并储存于-20 ℃待用。血清鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen， SCCA)采用I2000全自动化学发光分析仪及配套试剂(贝克曼库尔特，中国)进行检测；血清糖类抗原(carbohydrate antigen, CA)125采用E170型全自动电化学发光免疫分析仪(上海罗氏制药有限公司，中国)进行检测。③血清lncRNA NEAT1表达检测：采用Stratagene MX300P系统(安捷伦科技公司，美国)荧光定量PCR检测血清lncRNA NEAT1的表达水平。以RNA提取试剂盒提取样本血清总RNA，紫外分光光度法鉴定各样本提取的RNA纯度和完整性。按TaqMan miRNA反转录试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。lncRNA NEAT1上游引物：5′-GUCUGUGUGGAAGGAGGAATT-3′、下游引 物： 5′-UUCCUCCUUCCACACAGACTT-3′，内参GAPDH上游引物： 5′-GGGAGCCAAAAGGGTCHH-AT-3′、下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。实时荧光定量PCR反应体系20 μl：cDNA样本1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR Green Premix 8 μl，不含RNase去离子水10 μl。选择定量PCR反应程序，共40个PCR循环，定量PCR扩增条件:42 ℃，30 min；94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；60 ℃，80 s。以GAPDH为内参，采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

三、数据采集与分组

参照《NCCN宫颈癌临床实践指南(2018版)》[8]对患者进行治疗，采用标准的宫颈癌分期手术：ⅠA1期行筋膜外子宫切除术；ⅠA2期行改良广泛性子宫全切及盆腔淋巴结切除术；Ⅰ B1期至Ⅱ A期行广泛子宫切除术及盆腔淋巴结切除及腹主动脉旁淋巴取样；ⅡB期至Ⅲ期选择盆腔外照射+阴道近距离放疗+含铂同期化疗±主动脉旁淋巴结放疗。在患者术后第一次入院化疗时采集临床病理特征的相关数据，如病理类型、组织分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移等。根据宫颈癌组织分化程度和淋巴结转移情况，将所有患者分为以下4组：A组(高中分化无淋巴转移组，43例)，B组(高中分化有淋巴转移组，43例)，C组(低分化无淋巴转移组，43例)，D组(低分化有淋巴转移组，43例)[9-10]。4组患者基本情况构成差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 4组患者基本情况

四、观察指标

比较4组研究对象外周血中CD3+、CD4+、CD8+、Treg细胞数量和血清中lncRNA NEAT1、SCCA、CA125的表达水平以及血清lncRNA NEAT1表达水平和外周血T细胞亚群数量与宫颈癌患者临床病理特征的关系。

五、统计学分析

结 果

一、4组患者外周血T细胞亚群的水平的比较

C组患者CD3+T细胞水平显著低于A组，D组显著低于B组(P<0.05)；D组患者CD4+T细胞水平显著低于B、C组(P<0.05)，C组明显低于A组(P<0.05)；CD8+T细胞水平在4组患者血清中表达无统计学意义(P>0.05)；D组患者CD4+/CD8+比值显著低于B组(P<0.05)；C组患者Treg细胞数量显著高于A、B组(P<0.05)，D组显著高于B组(P<0.05)，见表2。

表2 4组患者外周血T细胞亚群水平的比较

二、4组患者血清中lncRNA NEAT1、SCCA和CA125表达水平的比较

A组患者lncRNA NEAT1表达显著高于B、C组，B、C组显著高于D组，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时检测患者血清中已知的、与宫颈癌诊断密切相关的SCCA及与上皮细胞病变相关的肿瘤表面抗原CA125的表达水平。结果显示，D组患者SCCA表达显著高于A、B、C组(P<0.05)；D组患者CA125表达显著高于A、B组(P<0.05)。见表3。

表3 4组患者血清中lncRNA NEAT1、SCCA、CA125表达水平的比较

三、患者血清lncRNA NEAT1和外周血T细胞亚群表达水平与临床病理特征的关系

宫颈癌患者血清lncRNA NEAT1水平与组织分化程度呈正相关(r=0.113，P<0.050)，与FIGO分期(r=-0.107，P<0.050)、淋巴结转移呈负相关(r=-0.082，P<0.050)，与肿瘤直径(r=-0.634，P>0.050)、浸润深度无关(r=-0.095，P>0.050)。在宫颈癌患者外周血中，CD3+T细胞水平与组织分化程度呈正相关(r=0.801，P<0.050)；CD4+/CD8+与组织分化呈正相关(r=0.185，P<0.050)，与淋巴结转移呈负相关(r=-0.598，P<0.050)；Treg细胞与FIGO分期(r=0.564，P<0.050)、淋巴结转移呈正相关(r=0.517，P<0.050)，与组织分化呈负相关(r=-0.729，P<0.050)，见表4。

表4 血清lncRNA NEAT1和外周血T细胞表达水平与临床病理特征相关性

讨 论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的生命健康。在该病发展的长期病理过程中，从上皮内瘤变连续演变成为宫颈癌，高危型HPV持续感染是宫颈癌发展的必要条件[9]。机会性筛查女性高危型HPV是否感染及宫颈细胞学检查是我国预防宫颈癌的重要手段，但对于已患宫颈癌的患者，目前尚缺乏有效的血清学肿瘤标志物。临床上主要采用SCCA辅助诊断鳞癌，但其诊断的敏感性和特异性有限，很难作为临床精准评估宫颈癌发展的参考指标。绝大多数指南均已将肿瘤体积变化作为患者治疗效果的最终评判依据，该方法有赖于超声结合具体参数进行最终判定[10-11]。目前临床上缺乏系统、完善的宫颈癌血清学预后评估方案用于患者预后的快速评价。因此，本研究从生物组学角度出发，尝试在宫颈癌患者的血清学肿瘤标志物及T细胞亚群检测方面进行探索，来评估其在患者预后评估中的应用价值。

lncRNA在多种肿瘤病理变化中发挥重要作用[12-13]。在宫颈病变的进化演变，如细胞分化、发育等过程中lncRNA扮演了重要角色[14]。Shen等[15]研究显示，lncRNA NEAT1通过调节 miR-124/NF-κB通路促进宫颈癌细胞的转移和侵袭，同时，宫颈癌组织和细胞中lncRNA NEAT1的表达与临床分期和淋巴结转移呈正相关。本研究结果提示，A组患者lncRNA NEAT1表达水平显著高于B、C组，同时B、C组显著高于D组；血清lncRNA NEAT1水平与组织分化程度呈正相关，与FIGO分期、淋巴结转移呈负相关；D组患者SCCA含量高于其他3组，D组患者CA125表达显著高于A、B组。随着患者病情进展，SCCA和CA125表达水平将明显增高，因此其表达水平一定程度上表明了患者肿瘤病变的严重程度。患者血清中高表达lncRNA NEAT1提示宫颈癌预后较好，低表达lncRNA NEAT1提示组织分化不良及高淋巴转移潜能。本研究结果与徐笑宇等[16]的报道相符，他们发现血清中lncRNA NEAT1在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者中表达降低，同时lncRNA NEAT1低表达提示宫颈癌患者组织分化程度差，并且lncRNA NEAT1术后水平明显高于术前水平。

T细胞亚群主要包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和Treg细胞，其亚群和功能处于动态平衡。随着宫颈病变的进展，患者外周血T淋巴细胞亚群水平会出现变化，且随着病情加重，可能引发细胞免疫系统失衡现象，导致免疫监视功能削弱或丧失[17]。肿瘤筛查中检测T淋巴细胞亚群，可为辅助检查、预后评估等提供依据[18]。CD3+T细胞与机体免疫功能成正相关，当CD3+T细胞水平降低时，机体的免疫功能同时也会变弱。本研究显示CD3+T细胞水平A组显著高于C组，B组高于D组，且CD3+T细胞水平与组织分化程度呈正相关，该结果提示低CD3+T细胞水平预示宫颈癌组织分化不良，机体免疫功能下降。宫颈癌患者机体免疫功能与正常人相比呈现降低的趋势，不同分期的宫颈癌其免疫功能降低的程度是不同的，随着宫颈癌临床分期的进展，机体免疫功能会呈现越来越严重的降低趋势[19-20]。CD4+T细胞是最重要的免疫反应调控中枢细胞，其水平降低会导致感染或者发生恶性肿瘤。我们的结果显示宫颈癌患者血清中CD4+T细胞数量A组高于C组，B组显著高于D组，提示低水平CD4+T细胞同样预示宫颈癌组织分化不良。CD8+T细胞是具有细胞毒性的T细胞亚群，在免疫反应中具有直接杀伤力，可清除被病原微生物感染的变异细胞[21]。本研究中CD8+T细胞在4组患者血清中表达无明显差异，但D组患者CD4+/CD8+比值显著低于B组，CD4+/CD8+与组织分化呈正相关，与淋巴结转移呈负相关。说明宫颈癌进展时CD8+T细胞数量增多，提示CD8+T细胞水平升高可能导致机体发生免疫缺陷及宫颈癌低分化，导致预后不良。

Treg细胞通过分泌IL-10与TGF-β等抑制性细胞因子、调节树突状细胞以及竞争性结合IL-2等多种途径抑制免疫细胞的功能，从而对CD4+与CD8+T淋巴细胞亚群的抗肿瘤效应产生抑制作用[22-24]。我们的结果显示，宫颈癌患者外周血Treg细胞数量C组显著高于A组，D组高于B组，且Treg细胞与FIGO分期、淋巴结转移呈正相关，与组织分化呈负相关，说明Treg细胞数量与宫颈癌病情进展的关系密切，外周血Treg细胞比例增加提示组织分化不良，有淋巴结转移潜能，促进宫颈癌的发生发展，其表达水平可初步评估宫颈癌的进展情况[24]。

综上所述，通过对lncRNA NEAT1和T细胞进行联合检测，低lncRNA NEAT1表达水平，同时低CD3+、CD4+T细胞水平、低CD4+/CD8+比值、高Treg细胞数提示宫颈癌组织分化低和癌细胞高淋巴转移潜能。本研究有助于初步评估宫颈癌患者组织分化及是否有淋巴转移等临床预后情况，对制定术后治疗方案具有一定的参考价值。但是本研究也有一定局限性，单因素研究仅阐释了各项指标可独立用于患者临床预后的判定，但是各指标单独使用时灵敏度、特异度如何，仍需进一步探究。后续研究需要构建模型进行多因素回归分析，多中心、大样本进一步分析各项指标联合用于宫颈癌患者预后评估的可能性。同时，本研究尚未进行长时间随访，lncRNA NEAT1和T细胞对患者长远预后如何，仍待后续观察。