不同品种紫苏叶迷迭香酸的提取及其生物活性

任志清，李会珍，张志军，N. Vasudeva Reddy，赵亚娜，李河

（中北大学化学工程与技术学院，山西太原 030051）

紫苏（Perilla frutescensL.）属于薄荷属唇形科植物，广泛分布于中国、日本、韩国、印度和其他东南亚国家，在中国紫苏被当作油料作物种植，并被用于保健品和医药品方面的开发[1,2]。紫苏叶中含有多种酚类化合物，例如迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶酸、绿原酸及其衍生物，其中迷迭香酸含量最高[3,4]。迷迭香酸是一种水溶性多酚类化合物，具有较强的清除自由基的活性，同时具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效。紫苏叶是抗氧化剂的重要来源，它有助于减少自由基对人体的损伤，能够降低脂质过氧化和减少不良胆固醇，从而有助于血液的健康循环[5-7]。

据报道，紫苏叶提取物中主要有迷迭香酸及其三种衍生物，包括迷迭香酸甲酯，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷和3’O-脱羟-迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷[8,9]。迷迭香酸的抗氧化能力强于维生素E，并且迷迭香酸能与脂质过氧基结合，从而降低脂质过氧化。迷迭香酸因其较强的抗氧化能力，在食品领域具有很好的应用市场[10]，迷迭香酸能够通过增强膜的通透性来抑制细菌和真菌的生长代谢[11]。目前，已经利用紫苏提取物研制出的药品、化妆品、饮料、食用油等产品[12,13]，被广泛用于治疗抑郁症[14]、过敏、哮喘、咳嗽和蛀牙[15,16]。

随着人们生活水平的提高，消费者更加追求优质食品，因此提高食品营养价值和延缓食品的氧化所导致的腐败就成为研究的热点。作为一种天然抗氧化剂，迷迭香酸可以延缓食品氧化，提高食品稳定性[17]，例如已经应用于沙棘果酒的发酵[18]；此外，它还具有抗菌活性，可以很好地代替化学合成型防腐剂，用于食品保鲜防腐[19]，在食品领域具有广阔的市场前景和现实意义[20]。目前，对于不同品种紫苏叶中迷迭香酸在食品方面的研究较少，本文主要研究不同品种紫苏叶中迷迭香酸含量及其抗氧化性和抑菌性，以期为天然抗氧化产品和食品防腐的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：紫苏叶，不同紫苏品种由课题组按产地命名编号，均种植于中北大学试验田，清洗叶片表面，于无阳光直射且通风处阴干至恒重，粉碎过80目筛，保存备用，45个紫苏品种信息见表1。

试剂：迷迭香酸标品（HPLC级，≥98%）：成都普菲德生物技术有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）：美国 Sigma公司；ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）：美国Sigma公司；XDA-8大孔树脂：天津欧瑞生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

表1 紫苏品种信息表Table 1 Information of perillavariety

1.2 仪器与设备

BJ-400型高速多功能粉碎机：北京普朗新技术科学仪器有限公司；SB-5200 DTDN超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5-A高速离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52 AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；中压制备液相色谱（配有二元溶剂输送泵、UV检测器、自动流份收集器）：瑞典Biotage公司；Agilent 1260高效液相色谱（Zorbax Eclipse XDA-C18 150×4.6 mm，5 μm column）：美国Agilent 公司；SPX-150 B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-75 KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；7220 N可见分光光度计：上海菁华科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫苏叶水提物的制备

参考薛姣[21]的方法并进一步优化制备紫苏叶活性物质。分别称取不同品种紫苏叶粉末20.00 g，按照料液比1:20加入蒸馏水，超声功率为300 W，超声温度为45 ℃，提取30 min。提取完成后5000 r/min，离心15 min，取上清液真空减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到紫苏叶提取物，4 ℃保存备用。

1.3.2 迷迭香酸含量的测定

参考李荣贵等[22]的方法测定紫苏叶提取物中迷迭香酸的含量。精确称取1.00 mg迷迭香酸标准品，溶于10 mL乙醇中，经稀释得到不同浓度的标准品溶液。配制5 mL反应体系：4 mL 0.10 mol/L NaAc缓冲液（pH为6.0），0. 03 mL 0.2 mol/L现配FeSO4溶液，0.2 mL样品溶液，0.77 mL蒸馏水，充分混匀，室温暗反应5 min，在568 nm下测其吸光度值。以迷迭香酸的浓度、吸光度值分别为横、纵坐标，绘制迷迭香酸的标准曲线方程为：y=0000.4x+0.001，相关系数R2=0.9993，可知吸光度值与迷迭香酸含量有极好的线性关系。样品溶液采用同样的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算迷迭香酸含量，每个样品重复三次，取平均值。计算公式如下：

1.3.3 大孔树脂柱色谱纯化紫苏迷迭香酸

参考薛姣[23]的方法经进一步优化。选用 XDA-8型大孔树脂湿法装柱，柱体积为25 mL，将样品配制成 5.00 mg/mL的溶液进行上样，吸附流速为 2.00 BV/h，当流出液的浓度为上样浓度的 1/10时停止上样；先用盐酸水溶液（pH 3.0）进行洗脱，至流出液无色时停止洗脱，最后用70%乙醇进行洗脱，洗脱流速为1.00 BV/h，洗脱剂用量12 BV，分段收集，当洗脱液的浓度保持不变时，停止洗脱，收集合并洗脱液，45 ℃烘24 h得紫苏水提物，备用。

1.3.4 中压制备色谱富集紫苏迷迭香酸

配制迷迭香酸浓缩液上样，以体积分数为0.1%的冰乙酸（A）和甲醇（B）为流动相，检测波长为320 nm。按表2中条件进行洗脱，根据色谱峰收集流份。

将洗脱液通过HPLC进一步检测其主要成分，流动相同上，进样量 10 μL，流速 1 mL/min，柱温：35 ℃，进样程序见表3。

表2 中压制备色谱洗脱梯度Table 2 The elution gradient of medium-pressure liquid chromatography

表3 HPLC进样程序Table 3 Sample injection procedure of HPLC

1.3.5 紫苏迷迭香酸抗氧化能力的测定

对纯化后样品进行抗氧化性测定。按照 Shimada等[24]的实验方法测定DPPH自由基的清除能力，在3 mL体系中分别加1 mL不同浓度样品溶液（20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 µg/mL）和 2 mL 1.00 mmol/mL DPPH自由基溶液，充分混匀3 min，室温暗反应30 min后，以无水甲醇为参比，在517 nm处测定样品吸光度As，同时测定DPPH自由基溶液的吸光度Ac，每个浓度重复3次，取平均值。计算清除率公式如下：

根据 Re等[25]的方法测定紫苏迷迭香酸清除ABTS自由基的能力。将7.00 mmol/mL ABTS自由基溶液添加到2.45 mmol/mL过硫酸钾中，在黑暗中反应12～16 h，直到吸光度稳定为止。该ABTS自由基阳离子溶液用 70%乙醇稀释至在 734 nm处的吸光度为0.02～0.07。将0.9 mL的该溶液添加到0.1 mL的待测样品溶液（20.00、40.00、60.00、80.00和100.00 µg/mL）中，并充分混合 45 s。将反应溶液在黑暗中反应 15 min，然后在734 nm处测定样品吸光度At。同时测定ABTS溶液吸光度值Ac，每个浓度重复3次，取平均值。清除率计算公式如下：

1.3.6 紫苏迷迭香酸抑菌能力的测定

滤纸片法测定抑菌圈选取迷迭香酸含量最高的三个品种进行抑菌性研究，将迷迭香酸配制成 1.25、2.50、5.00 mg/mL溶液，以5%苯甲酸钠为阳性对照。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别于LB液体培养基中活化，当吸光度值达到0.2～0.4时用生理盐水将其稀释成一定浓度的菌悬液。向每个加有固体培养基的平板各加入100 μL的菌悬液，涂布均匀后，于平板中等距放入4个直径为6.00 mm无菌滤纸片，分别在滤纸片上滴加15 μL待测溶液，将平板于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，测量其抑菌圈直径[26]，每次试验做三个平行。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行方差统计分析（LSD，p＜0.05），除有特殊说明外，试验均进行3次平行试验，结果以“平均值±标准偏差”表示；采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 紫苏叶片迷迭香酸含量与清除 DPPH自由基能力测定

不同品种紫苏叶中迷迭香酸的含量如图1所示，方差分析结果F值为282.79，p值为0.04＜0.05，所以不同品种紫苏叶提取物中迷迭香酸的含量具有显著性差异。由图1可得不同紫苏提取物中迷迭香酸含量变化范围为4.69%～7.87%，ZY7-1、ZB3、DZ-1粗提物中迷迭香酸含量最高，分别为7.87%、7.34%、7.32%。含量最低的是HB，为4.69%，仅为ZY7-1的0.59倍。

图1 不同品种紫苏叶中迷迭香酸的含量Fig.1 Content of rosmarinic acid in leaves of different varieties of Perilla

图2所示为不同品种紫苏粗提取物清除DPPH自由基的IC50，F值为2430.94，p值为0.01＜0.05，所以不同品种间紫苏叶提取物对DPPH自由基的清除率也具有显著差异，由图知ZY7-1、ZB3、DZ-1粗提取物对DPPH自由基的清除能力最强，IC50值分别为85.18 μg/mL、87.22 μg/mL 和88.45 μg/mL，而ZY10T的清除能力最弱，QY 次之，IC50分别为 110.36、105.86 μg/mL。

图2 不同品种紫苏迷迭香酸清除DPPH自由基的IC50Fig.2 The IC50 of different varieties of Perilla rosmarinic acid in scavenging DPPH free radicals

利用SPSS Statistics对迷迭香酸含量与DPPH自由基清除率进行相关性分析（图3），根据建立的模型得回归方程为y=10.1546x+0.7711，相关系数R2为0.9963，呈显著正相关（p＜0.05），故选取这三个品种进行后续纯化试验。

图3 紫苏迷迭香酸含量对提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.3 Effect of rosmarinic acid on DPPH free radical scavenging ability of Perilla extract

2.2 迷迭香酸的富集纯化

经大孔树脂纯化后，ZY7-1、ZB3、DZ-1提取物中迷迭香酸含量分别提高到37.30%、32.65%、32.02%。将纯化后样品通过中压制备色谱进行再次分离纯化，经多次实验调整洗脱程序和参数，优化洗脱工艺，确定上样量为1 mL，上样浓度为5 mg/mL，洗脱流速为15 mL/min，当流速大于15 mL/min时色谱峰会出现拖尾现象。

图4 紫苏提取物的中压制备色谱图Fig.4 Chromatogram of medium-pressure preparation of rosmarinic acid standard and Perilla extract

图4分别为三种紫苏迷迭香酸的色谱图，收集图中ZY7-1峰2、ZB3峰3、DZ-1峰2的洗脱液，测定迷迭香酸含量分别为：59.28%、54.41%、51.13%，同时测定多酚含量为 76.62%、72.13%、70.43%，其中迷迭香酸分别占77.36%、75.43%、72.59%。

图5 迷迭香酸标准品与洗脱液的HPLC图Fig.5 HPLC of rosmarinic acid standard and eluent

进一步通过HPLC检测物质成分，结果如图5，与迷迭香酸标准品对照可知该流分主要物质为迷迭香酸。

2.3 紫苏叶迷迭香酸抗氧化能力的测定

2.3.1 紫苏迷迭香酸对DPPH自由基的清除能力

DPPH能够提供稳定的自由基，当反应体系中存在抗氧化物质时，溶液体系颜色逐渐变浅，从而根据吸光度值的大小可测定物质的抗氧化能力[27,28]。迷迭香酸标准品做阳性对照，由图6可知，纯化后的三个紫苏迷迭香酸对DPPH自由基的清除率均随浓度的增加而增大，当达到100 μg/mL时，清除率基本保持不变。当浓度为 120.00 μg/mL时，迷迭香酸标准品、ZY7-1、ZB3、DZ-1对 DPPH 自由基清除率分别为94.25%、89.82%、82.65%、79.12%，IC50值分别为9.12、15.13、19.08、20.91 μg/mL，因此可知三个品种紫苏迷迭香酸均具有一定的清除DPPH自由基的能力。

图6 三个品种紫苏迷迭香酸对DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radical by rosmarinic acid of three Perilla varieties

2.3.2 紫苏迷迭香酸对ABTS自由基的清除能力

利用ABTS法测定物质抗氧化性时，ABTS经过硫酸钾氧化后产生稳定的蓝绿色物质-ABTS自由基，当反应体系存在抗氧化剂时，会与ABTS自由基结合，使溶液颜色变浅[29]。图7结果显示随着浓度的增加三个样品对ABTS自由基的清除率逐渐增大，但低于迷迭香酸标准品的清除率，当浓度为120.00 μg/mL时，迷迭香酸标准品、ZY7-1、ZB3、DZ-1对ABTS自由基清除率分别为95.63%、87.08%、81.99%、80.23%。IC50值分别为 18.34、26.57、33.11、36.59 μg/mL，故三个品种紫苏迷迭香酸均对ABTS自由基有一定的清除能力。

图7 三个品种紫苏迷迭香酸对ABTS自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS free radical by rosmarinic acid of three Perilla varieties

2.3.3 迷迭香酸含量与紫苏叶提取物抗氧化性的相关性

从45个品种选取10个迷迭香酸含量较高的品种比较其清除不同自由基的IC50。从图8可以看出，紫苏叶提取物中迷迭香酸含量与清除 DPPH自由基、ABTS自由基的IC50呈极显著负相关（p＜0.01），迷迭香酸含量越高，IC50越小，其清除自由基能力越强，表明迷迭香酸是紫苏叶提取物清除自由基的主要有效成分之一。

图8 迷迭香酸含量与清除DPPH自由基（a）、ABTS自由基（b）IC50的相关性Fig.8 Correlation between rosmarinic acid content and scavenging DPPH free radical (a), ABTS free radical (b) IC50

2.4 紫苏迷迭香酸抑菌性的测定

紫苏迷迭香酸对三种供试菌种的抑菌圈直径见表4，图9是呈现了三个品种紫苏迷迭香酸对三种不同供试菌的抑制效果。

表4可知，不同品种紫苏迷迭香酸对三种供试菌的生长均具有一定程度的抑制作用，并且抑菌能力随着迷迭香酸浓度的降低而减弱。ZY7-1对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强，浓度为20.00 mg/mL时抑菌圈直径最大，为12.50±0.26 mm；ZB3对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强，最大抑菌圈直径为 11.80±0.10 mm；DZ-1对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强，最大抑菌圈直径为12.40±0.14 mm，三个品种的紫苏提取物均对大肠杆菌的抑制能力最弱。图 9是选取浓度为5.00、10.00、20.00 mg/mL的紫苏迷迭香酸溶液的抑菌图，阳性对照为 5%的苯甲酸钠，可以看出在一定浓度范围内随着迷迭香酸浓度增加抑菌效果更加明显。

图9 三个品种紫苏迷迭香酸的抑菌能力Fig.9 Antibacterial ability of three different varieties of perilla rosmarinic acid

表4 不同浓度紫苏迷迭香酸对各供试菌种的抑菌圈直径d(mm)Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Perilla rosmarinic acid at different concentration (mm)

3 结论

本文从45个不同品种紫苏叶中提取迷迭香酸，并检测其对DPPH自由基的清除能力，进一步对含量最高的3个较优品种ZY7-1、ZB3、DZ-1的抗氧化性及抑菌性进行研究。实验结果表明，不同品种紫苏所含迷迭香酸含量不同，3个较优品种经过大孔树脂柱色谱以及中压制备色谱分离纯化后迷迭香酸含量由7.87%、7.34%、7.32%提高到59.28%、54.41%、51.13%。3个品种均具有较强的抗氧化性，迷迭香酸标准品对清除 DPPH自由基、ABTS自由基的 IC50值分别为9.12、18.34 μg/mL，而ZY7-1、ZB3、DZ-1清除DPPH自由基的IC50值分别为：15.03、19.08、20.91 μg/mL；清除ABTS自由基的IC50值分别为：26.57、33.11、36.59 μg/mL，而且迷迭香酸含量与清除自由基的IC50值呈极显著负相关。三个品种紫苏迷迭香酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长均具有一定的抑制效果。ZY7-1和ZB3对金黄色葡萄球菌的的抑制作用较大肠杆菌和枯草芽孢杆菌强，最大抑菌圈直径分别为：12.50 mm、11.80 mm；DZ-1对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，最大抑菌圈直径为12.40 mm。目前鲜有利用中压制备色谱分离纯化紫苏迷迭香酸的研究，本研究结果为紫苏作为抗氧化剂的应用提供了理论基础，也为紫苏的品种选育以及开发新的天然抗氧化剂提供了依据。