高效液相色谱法测定化妆品中防晒剂奥克立林含量的不确定度评定

邸 铮， 贾伯阳， 周 荔， 王 颖， 左 雪, 张 蓉， 邬国庆

(北京市药品检验所，北京 102206)

1 引 言

防晒类化妆品属特殊用途化妆品，其中含有的防晒剂成分是利用光的吸收、反射或散射作用加入的物质，用于保护皮肤免受紫外线伤害[1]。《化妆品安全技术规范》(2015年版)(以下简称“规范”)中规定了27种准用防晒剂，并提供了15种防晒剂测定的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)。其中，奥克立林(化学名称：2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯)属于UVB(320～290 nm)紫外吸收剂，多用于高SPF(防晒指数)的产品中[2,3]，是经美国FDA批准的I类防晒剂，也因其具有稳定的化学性质，且吸收率高、无毒、无致畸作用[4]，成为目前高端化妆品使用频次较高的一种防晒剂。

对于化妆品中防晒剂的监测，一直是化妆品监督抽验与安全风险监测工作的重点内容。为确保实验室维持较高的防晒剂检测水平，及时发现和纠正在检验过程中存在的问题，严格控制和提高实验室的质量管理水平，本实验室参加了防晒剂中奥克立林的能力验证工作，并通过建立数学模型，分析了对结果产生影响的不确定度来源。测量不确定度是对测量结果可能误差的度量，也是定量说明测量结果质量好坏的一个参数[5]。目前，对于化妆品中防晒剂测定不确定度的评定鲜有报道。

本文依据测量不确定度评定准则[6～9]，采用规范方法，对能力验证样品中奥克立林含量进行测定，建立了高效液相色谱法测定化妆品中防晒剂的不确定度评定方法，通过分析不确定度的来源，寻找影响检测结果的关键因素，为提高防晒剂的检测水平提供了参考依据。

2 仪器与实验材料

2.1 仪 器

e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；XS 205D电子分析天平(瑞士Mettler公司)。

2.2 实验材料

10，25，50 mL容量瓶，1，2 mL单标线吸量管，5 mL分度吸量管，依据JJG 196-2006常用玻璃量器[10]检定规程检定为A类；能力验证样品(性状：白色乳液，来源：中国食品药品检定研究院，样品编号：TC 137-134)；奥克立林对照品(来源：德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，纯度：98.0%)；甲醇、四氢呋喃为色谱纯(来源：德国Merck公司)；高氯酸为分析纯(来源：天津政成化学制品有限公司)，水为超纯水。

3 试验方法

3.1 色谱条件及系统适应性

SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6 mm×25 cm；5 μm)；流动相为甲醇：四氢呋喃：高氯酸水溶液(0.2 mL高氯酸+300 mL水)梯度洗脱，见表1；检测波长为311 nm，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min。在此条件下奥克立林与甲氧基肉桂酸乙基己酯的分离度大于1.5，理论塔板数为66 873。

表1 HPLC梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC (%)

3.2 对照品及标准曲线溶液制备

精密称取奥克立林对照品12 mg置于10 mL容量瓶中，加四氢呋喃溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。再精密量取5 mL置于50 mL量瓶中，加混合溶液(甲醇+四氢呋喃+水+高氯酸=250+450+300+0.2,单位mL)稀释至刻度，得对照品溶液Std5，再精密量Std5溶液0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分别置于 10 mL容量瓶中，加混合溶液稀释至刻度，得对照品标准曲线溶液Std1～Std4。

3.3 供试品溶液制备

取供试品搅拌均匀，精密称取0.25 g置25 mL容量瓶中，混合溶液溶解，涡旋混匀，超声振提30 min后混合溶液定容至刻度，混匀，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加混合溶液稀释至刻度。经0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

3.4 测定方法

分别精密吸取对照品标准曲线溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，利用标准曲线法计算含量。

3.5 数学模型

供试品中奥克立林的含量测定公式表示为：

(1)

式中：W为供试品中被测组分的含量(以酸计)，%；C为供试品中被测组分的浓度，μg/mL；V为供试品溶液定容体积，mL；M为供试品称样量，g；0.689 6为奥克立林由酯折算为酸的折算系数。

4 结果与分析

4.1 不确定度的来源

从检测过程和数学模型分析，奥克立林含量的不确定度来源主要有以下几方面：(1) 对照品的纯度(PR),称样量(MR),对照品标准曲线的制备(VR)和拟合(Ci)；(2) 供试品称样量(MS),溶液制备(VS),供试品的重复测量(SS);(3) 对照品的积分峰面积重复性(R)。高效液相色谱法的不确定度通过对照品重复性测量予以体现。

4.2 不确定度分量的评定

4.2.1 标准溶液及工作曲线对不确定度的贡献

(1) 对照品纯度的相对标准不确定度urel(PR)

证书上标注奥克立林对照品的纯度为98.0%，不确定度为0.5%，则由对照品引入的不确定度

(2) 对照品称量的相对标准不确定度urel(MR)

称量值m=12.03 mg，其称量不确定度来源有3项：①重复性；②数字分辨率，即可读性；③天平校准产生的不确定度的分量。

因天平称量两次(一次称样，一次称皮重)，故

则对照品称量的相对标准不确定度为：

urel(MR)=u(MR)/m=
0.129/12.03=0.010 7

(3) 对照品溶液配制的相对标准不确定度urel(CV)

配制标准溶液时所用吸量管、容量瓶带来的不确定度，分为：①u(CV(V))，吸量管、容量瓶校准不确定度；②u(CV(T))，温差导致溶液膨胀的不确定度。需用到的玻璃器具见表2。

表2 玻璃仪器列表[11～13]Tab.2 List of glass instruments mL

表3 吸量管和容量瓶引入的不确定度Tab.3 Uncertainty introduced by measuring pipet and measuring flask

根据表3各分量相对标准不确定度结果，求得 合成相对标准不确定度：

(4) 标准曲线拟合引入的不确定度urel(Ci)

配制标准曲线溶液，每一浓度测定2次，以浓度Xi为横坐标，峰面积Yi为纵坐标，拟合标准曲线得线性方程(Yi=a+bXi)，液相色谱校正表拟合的标准曲线为：Y=7531+19878X，相关系数r=0.999 9。对同一样品进行了6次测量，浓度平均值C0=12.393 μg/mL。

按式(2)计算Yi残差的标准偏差，按式(3)计算奥克立林浓度的标准不确定度，相关量值的计算结果见表4。

表4 标准曲线拟合引入的不确定度Tab.4 Uncertainty introduced by the standard curve fitting

(2)

(3)

(4)

式中：Yij为由仪器测得标准曲线各浓度点对应的峰面积测定值；Yi为由线性方程得标准曲线各浓度点对应的峰面积计算值；C0为由线性方程计算得到的样品浓度平均值, μg·mL-1；P为样品测定次数(P=6)；n为标准曲线溶液的浓度个数(n=5)；m为标准曲线溶液各点浓度的重复测量次数(m=2)；Xij为标准曲线系列溶液的浓度测定值,μg/mL。

则标准曲线拟合的相对标准不确定度为：

urel(Ci)=0.084 2/12.393=0.006 79

(5) 标准溶液及工作曲线引入的相对标准不确定度由urel(PR)、urel(MR)、urel(CV)、urel(Ci)合成，即：

=0.013 9。

4.2.2 供试品制备对不确定度的贡献

(1)供试品称量引入的不确定度urel(MS)

单次称量的标准不确定度：

天平称量两次

供试品称量的相对标准不确定度为：

urel(MS)=u(MS)/M=0.912/253.6=0.003 60

(2) 供试品定容体积引入的不确定度urel(VS)

供试品用提取溶剂超声并定容至25 mL容量瓶中，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中。其不确定度来源有3项：1 mL单标线刻度管、10 mL、25 mL容量瓶容积带来的校准不确度u1(V)和温差带来的不确定度u2(V)。参考第4.2.1(3)节中容量瓶的不确定度评定方式及玻璃器具列表2，计算结果见表5。

表5 定容体积引入的不确定度计算Tab.5 Uncertainty introduced by constant volume

由供试品定容体积引入的相对标准不确定度：

(3) 供试品重复性测定引入的不确定度urel(SS)

urel(SS)=0.003 09/0.843=0.003 67。

(4) 供试品制备引入的不确定度urel(M)

供试品制备引入的相对标准不确定度由urel(MS)、urel(VS)、urel(SS)合成，即：

= 0.006 02。

4.2.3 测量重复性对不确定度的贡献Urel(R)

取浓度为11.79 μg/mL的标准曲线溶液重复测量5次(n=5)，测定结果见表6。

表6 重复性试验测定结果Tab.6 Determination result of repeatability test

利用贝塞尔公式计算求得实验标准差后，用平均值标准差表示重复性标准不确定度。

urel(R)=u(R)/A

=871/244 638=0.003 56。

4.3 合成不确定度urel(W)

各分量相对标准不确定度见表7所示。

合成不确定度为：

=0.015 6

实验中测得奥克立林含量平均值H为0.843%，则

u(W)=urel(W)×H

=0.015 6×0.843%=0.013 2%

4.4 扩展不确定度U95及测定结果报告

取扩展因子k=2(置信度为95%)，则奥克立林的扩展不确定度为

U95=k×u(W)
=2×0.013 2%=0.026%

当奥克立林测定结果为0.843%时，则含量的结果表示为

(0.843±0.026)%；k=2。

5 结 论

从各不确定度分量分析可知，化妆品中奥克立林的不确定度贡献主要来源于标准溶液的配制及工作曲线的拟合，特别是当对照品称量较小时，对不确定度影响较大。在试验过程中可适当增加对照品的取样量，并做到规范操作，减小曲线配制过程中产生的不确定度，以保证测量结果有更高的准确度。

化妆品中防晒剂过量添加会引起光敏性反映，严重的可致癌[14]，但目前对于化妆品中防晒剂等限用组分的不确定度评定报道不多，当检验结果出现边缘值时，本文提出的不确定度评定方法有助于评价化妆品中限用物质的含量范围，为化妆品的风险监测提供了参考依据。