烟色离褶伞液体菌种培养条件优化及工厂化栽培研究*

刘 娜，张 敏，张士义，李宏亮，宋 莹

（辽宁省农业科学院食用菌研究所辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，辽宁 沈阳 110161）

烟色离褶伞（Lyophyllum fumosumy），系伞菌目（Agaricales） 离褶伞科 （Lyophyllaceae） 离褶伞属（Lyophyllum）真菌[1]。烟色离褶伞在辽宁地区享誉盛名，风味独特，被当地百姓视为珍品[2]。近年来，由于生境变化和人类活动等的影响，野生烟色离褶伞已濒临灭绝，而烟色离褶伞的普通温室人工栽培周期长，栽培难度很大。目前，人工培育烟色离褶伞的难题是制种和催蕾，其育种期约90 d，催蕾期对光照、温度、湿度等要求严格。目前，烟色离褶伞在日光温室内以秸秆、稻草为主料进行菌袋码堆墙式出菇，工序繁琐，环境条件无法精确控制，生物学效率仅为55%左右[3]。而工厂化栽培烟色离褶伞比自然条件或辅助设施栽培更能够准确控制温度、湿度、光线、二氧化碳浓度等环境条件[4]。因此，利用液体菌种为原种，用于工厂化栽培出菇，可使菌种生产周期大幅度缩短。在优化液体菌种培养条件的同时，开展了烟色离褶伞工厂化栽培技术初探，以期为烟色离褶伞工厂化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

烟色离褶伞菌株，由辽宁省农业科学院食用菌研究所遗传育种研究室提供。原种采自彰武县四合城乡，纯化后经中国科学院微生物研究所鉴定命名为烟色离褶伞。

1.1.2 液体菌种基础培养基配方

马铃薯20%、葡萄糖2%，蛋白胨0.20%、磷酸二氢钾0.30%、硫酸镁0.15%，自来水定容至1 000 mL。

1.2 液体菌种培养条件优化单因素试验

设计碳源、氮源、外源营养、培养温度4个液体菌种培养条件的单因素试验。除温度试验外，其余试验均在25℃条件下培养（250 mL三角瓶培养液的装液量为100 mL，用6 mm打孔器取菌种2块接入液体培养基），培养8 d时，通过测量菌丝生物量、菌球密度及菌球直径确定最佳单因素培养条件[5]。

1.2.1 碳源

在每升基础培养基中分别加入2.0%的木糖、果糖、海藻糖、蜜糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、山梨醇替代葡萄糖，包括基础培养基共配成10种碳源培养基。

1.2.2 氮源

在每升基础培养基中分别加入0.2%的酪蛋白氨基酸、尿素、酵母膏、氯化铵、牛肉膏、黄豆粉替代蛋白胨，包括基础培养基共配成7种氮源培养基。

1.2.3 外源营养

在每升培养基中分别加入0.6 g复合维生素B（维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、泛酸、烟酸）、0.5%的草炭土、玉米秸秆、玉米芯及草炭加麦麸（3∶1）、玉米秸秆加麦麸（3∶1）、玉米芯加麦麸（3∶1）提取液，共7种外源营养培养基。

1.2.4 培养温度

将液体菌种分别放入23℃、25℃、28℃摇床，转速均为 150 r·min-1。

1.3 液体菌种培养条件优化的正交试验

根据单因素试验结果，确定最佳摇瓶培养条件的碳源、氮源和外源营养，设计L9（33）正交试验，每组试验设3个重复[7]，通过测定菌丝生物量确定最佳烟色离褶伞液体菌种最佳培养配方。试验因素及水平见表1。

表1 试验因素及水平Tab.1Factors and levels of L9（33）orthogonal test

1.4 工厂化栽培研究选择

1.4.1 各条件选择

1） 培养基配方

菌丝培养期间温度为25℃，黑暗培养；出菇阶段温度为16℃～18℃，湿度90%～97%。设置3个工厂化栽培培养基配方，分别为：配方1（草炭78%、麦麸20%、石膏1%和石灰1%）；配方2（草炭28%、玉米芯25%、玉米秸秆25%、麦麸20%、石膏1%和石灰1%）；配方3（菌糠40%、秸秆38%、麦麸20%、石膏1%和石灰1%）。采用850 mL聚丙烯瓶，覆土栽培，每个配方生产100瓶。

2）人工栽培容器选择

选用500 mL罐头瓶（培养基装1/2、装满瓶）、850 mL细口聚丙烯瓶、30 cm×30 cm×15 cm聚丙烯盆、耐高温广口丙烯组培瓶2组（高14.0 cm，口径11.4 cm，底面直径 10.0 cm；高 8.5 cm，口径 9.5 cm，底面直径8.3 cm）进行覆土栽培（草炭土厚度0.5 cm）。

3） 覆土与未覆土

采用细口聚丙烯瓶栽，搔菌后进行覆土与未覆土2种处理方式，草炭土覆土厚度为0.5 cm。

1.4.2 检测数据

观察各菌株子实体的形态特征，不同栽培条件重复随机选取10个子实体，测量菌盖直径、菌盖厚度及菌柄长度、菌柄直径，取其平均值。用DPS数据处理系统对试验结果进行方差分析。生物学效率（BE，%）的计算公式为：

BE=Ffw/Sdw×100%

式中：Ffw表示子实体鲜重（g）；Sdw表示培养料干重 （g）。

1.4.3 人工栽培和野生烟色离褶伞营养成分测定

委托中国科学院沈阳生态所农产品安全与环境质量检测中心检测其干品18种氨基酸、粗多糖、蛋白质等含量。

2 结果与分析

2.1 液体菌种单因素试验结果

2.1.1 碳源对烟色离褶伞菌丝生长的影响

不同碳源对烟色离褶伞菌液体菌种菌丝生长情况的影响见表2。

表2 不同碳源液体菌种菌丝生长情况Tab.2 Effects of different carbon source on mycelial growth

由表2可知，综合比较，2%麦芽糖菌球密度最大，菌丝生物量最重，菌球直径相对较小、整齐，因此烟色离褶伞液体培养的最适碳源为麦芽糖。

2.1.2 氮源对烟色离褶伞菌丝生长的影响

不同氮源对烟色离褶伞菌液体菌种菌丝生长情况的影响见表3。

表3 不同氮源液体菌种菌丝生长情况Tab.3 Effects of different nitrogen source on mycelial growth

由表3可知，尿素抑制菌球生长。综合比较，0.2%黄豆粉菌球密度最大，菌球直径最小、整齐，菌丝生物量相对较重，因此烟色离褶伞液体培养的最适氮源为黄豆粉。

2.1.3 外源营养物对烟色离褶伞菌丝生长的影响

不同外源营养物对烟色离褶伞菌液体菌种菌丝生长情况的影响见表4。由表4可知，综合比较，0.6 g·L-1复合维生素B菌球密度最大，菌球直径最小、整齐，菌丝生物量相对较重，因此烟色离褶伞液体培养的最适外源营养物为复合维生素B。

2.1.4 温度对烟色离褶伞菌丝生长的影响

不同温度对烟色离褶伞菌液体菌种菌丝生长情况的影响见表5。由表5可知，综合比较，23℃菌球密度最大，菌球直径最小、整齐，菌丝生物量相对较重，因此烟色离褶伞液体培养的最适温度为23℃。

2.2 液体菌种正交试验结果

最佳培养条件液体菌种正交试验结果见表6，液体菌种生长情况见图1。由表6、图1可知，正交试验结果验证确定烟色离褶伞菌种培养最佳组合为A3B2C2，即碳源麦芽糖2.5%，氮源黄豆粉0.2%，外源营养复合维生素B 0.6 g·L-1，而且液体菌种菌球颗粒小、密度大。

表4 不同外源营养物对液体菌种菌丝生长情况Tab.4 Effects of different exogenous compound on mycelial growth

表5 不同温度液体菌种菌丝生长情况Tab.5 Effects of different temperature on mycelial growth

2.3 工厂化栽培研究结果

2.3.1 培养基配方试验结果

工厂化栽培不同配方对烟色离褶伞农艺性状的影响见表7。由表7可知，烟色离褶伞菌丝在3种培养料中均可生长和出菇。配方3从接种到出菇所用时间最短，为68 d～72 d，配方2最慢，但配方2的生物学效率明显高于配方1和配方3，达68%；子实体颜色均为灰色，3个配方菌盖大小及厚度差异不明显，配方1菌柄明显短于其他2个配方。

2.3.2 不同栽培方式试验结果

不同栽培方式对烟色离褶伞农艺性状的影响见表8。由表8可知，6种栽培方式均能出菇，菌龄与培养料多少有关，采用耐高温聚丙烯组培瓶栽培（小），子实体菌盖明显小于其他5种栽培方式，菌柄长于其他3种栽培方式。生物学效率差异明显，生物学效率大小依次为细口聚丙烯瓶栽＞盆栽＞耐高温广口聚丙烯组培瓶（大） ＞罐头瓶（满） ＞聚丙烯广口组培瓶（小）＞罐头瓶（1/2）。细口聚丙烯瓶由于瓶口小，养分供应比较集中，氧气含量较低，保湿性好，菇蕾发生整齐，菇柄长，子实体生长整齐，产量明显高于其他几种出菇方式。

2.3.3 覆土试验结果

覆土栽培与未覆土栽培对烟色离褶伞农艺性状的影响见表9。由表9可知，未覆土烟色离褶伞菌株比覆土栽培生育期短约5 d，子实体农艺性状指标小于覆土栽培，栽培生物学效率为66%，覆土后生物学效率达68%，生物学效率差异不明显，从节约成本角度考虑工厂化栽培可以不覆土处理。

2.3.4 人工栽培和野生烟色离褶伞营养成分检测

烟色离褶伞营养成分分析结果见表10。由表10可知，野生烟色离褶伞子实体中蛋白质含量为32.200 0%，粗多糖含量为6.450 0%，18种氨基酸总量为20.270 7 g·100-1g-1；栽培烟色离褶伞蛋白质含量为32.000 0%，粗多糖含量为3.020 0%，18种氨基酸含量19.393 0 g·100-1g-1。人体必需氨基酸含量中，人工栽培的烟色离褶伞含量为8.014 6 g·100-1g-1，比野生含量（6.530 8 g·100-1g-1）高1.483 8 g·100-1g-1。

3 结论

烟色离褶伞菌种最佳营养条件为碳源麦芽糖2.5%，氮源黄豆粉0.2%，外源营养复合维生素B 0.6 g·L-1。采用此配方，摇床培养温度为23℃的条件下菌球颗粒小、密度大，菌丝生物量最高；工厂化栽培培养基配方草炭28%、玉米芯25%、玉米秸秆25%、麦麸20%、石膏1%、石灰1%，子实体产量最高为68%；烟色离褶伞工厂化栽培宜选用聚丙烯瓶；试验菌株采用覆土方式生物学效率略高于未覆土，但将增加人工成本，因此可不进行覆土处理；野生烟色离褶伞和人工栽培的干品子实体中蛋白质含量近似，野生烟色离褶伞中氨基酸总量和粗多糖总含量均高于人工栽培的烟色离褶伞，但在人体必需氨基酸含量中，人工栽培比野生的烟色离褶伞高1.483 8 g·100-1g-1。

表7 不同配方对烟色离褶伞农艺性状的影响Tab.7 Effects of different formulas on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表8 不同栽培方式烟色离褶伞农艺性状的影响Tab.8 Effects of different cultivation method on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表9 覆土与未覆土对烟色离褶伞农艺性状的影响Tab.9 Effect of covering soil on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表10 烟色离褶伞营养成分分析Tab.10 Nutritional components analysis of cultivated and wild Lyophyllum fumosum

烟色离褶伞氨基酸总量明显高于金针菇13.686 g·100-1g-1～16.096 g·100-1g-1[8]，蛋白质含量远远高于白玉菇 17.56 g·100-1g-1[9]、真姬菇 22.30 g·100-1g-1[10]、杏鲍菇20.00 g·100-1g-1[11]。烟色离褶伞是一种高蛋白、低脂肪营养价值极高的食用菌新品种，但对其成分分析却较少，许多潜在价值尚未得到开发利用[12]。因此，今后应加强对烟色离褶伞子实体深加工及产物成分和主要功能的研究，为烟色离褶伞市场开发奠定基础。