二氧化硫通过调控MMP-3/TIMP-1表达改善急性心肌梗死大鼠心肌纤维化

刘佳丽 张爱民 向长铁 吴倩 聂连桂 刘茂军 杨军

(南华大学附属第一医院心内科，湖南 衡阳 421001)

急性心肌梗死(AMI)近年来在我国的患病率及死亡率均呈逐步增长趋势〔1〕。尽管血运重建使许多患者存活，但AMI后患者仍可以发生负性心肌重构并可发展为心力衰竭，从而明显影响疾病预后。AMI后心肌重构主要表现为心肌纤维化(MF)，其机制与心肌梗死后大量心肌细胞丢失，心肌成纤维细胞(CFs)增殖活化和细胞外基质蛋白(ECM)过度沉积有关〔2〕。基质金属蛋白酶(MMPs)和MMPs抑制剂(TIMPs)两者相互作用共同调控着ECM的动态平衡〔3〕，已发现MF发生机制与 MMPs/TIMPs失调有关。二氧化硫(SO2)作为新型的内源性气体信号分子，有研究发现SO2具有通过抑制心肌细胞凋亡和内质网应激从而改善心脏功能〔4，5〕，但SO2能否改善AMI后的MF和心肌负性重构尚缺乏相关研究，本研究拟探讨SO2可否通过调控MMP-3/TIMP-1蛋白的表达改善异丙肾上腺素(Iso)诱导的AMI大鼠的MF。

1 材料与方法

1.1实验动物 取健康雄性成年SD大鼠40只，体重(250±20)g，购于南华大学动物实验中心，饲养于恒温(22±2)℃恒湿环境中，昼夜交替各12 h，能自由获得水和饲料。

1.2实验试剂 Iso购于中国大连美仑生物公司，亚硫酸钠(Na2SO3)和亚硫酸氢钠(NaHSO3)购于美国Sigma公司，兔一抗MMP13、TIMP1、GAPDH及羊抗兔二抗购于美国 Proteintech公司，BCA蛋白定量试剂盒及细胞裂解液由中国碧云天生物公司提供，Masson染色试剂盒由中国迈新生物技术开发公司提供。

1.3动物模型的建立及分组 首先，在上述环境中将40只SD大鼠适应性喂养1 w后，然后随机分成正常对照(Control)组、模型(Iso)组、SO2干预(Iso+SO2)组、SO2对照(SO2)组，每组各10只。按文献建立AMI大鼠模型，以Iso 50 mg/(kg·d)腹腔注射持续2 d，Control组及SO2组大鼠则腹腔注射等量生理盐水，行心电图及血浆肌钙蛋白检测确定造模成功后，Iso+SO2组和SO2组大鼠腹腔注射Na2SO3/NaHSO3溶液(0.54±0.18) mmol/(kg·d)共4 w〔4〕，Control组及Iso组大鼠则腹腔注射等量生理盐水共4 w。

1.4组织提取 持续4 w后，腹腔注射10%的水合氯醛将大鼠麻醉，开胸后剪取心脏并保留左室及室间隔，用4%的多聚甲醛固定适量心肌组织备用Masson染色，-80℃冰箱冻存剩余心肌组织备用Western印迹检测。

1.5Masson染色 每组均将适量心肌组织用甲醛固定的，依次将石蜡包埋切片、脱蜡至水，取Weigert铁苏木素染5 min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝，丽春红酸性品红液染5～10 min，蒸馏水快速漂洗，磷钼酸水溶液处理约3～5 min，苯胺蓝夜复染5 min，1%的冰醋酸分化处理1 min，无水乙醇脱水后二甲苯透明并予以中性树胶封固，光镜下观察各组心肌组织胶原沉积情况。

1.6Western印迹检测蛋白表达 每组均称量适量新鲜的左心室心肌组织，剪碎后加入细胞裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)，然后放置于冰上，进行多次充分研磨，裂解30 min分钟后提取上清液，测定蛋白浓度，进行电泳，予以配胶、上样、转膜、封闭、孵育一抗(GAPDH、MMP-3、TIMP-1)4℃过夜、TBST漂洗3次(10 min)、孵育二抗(羊抗兔)1 h(37℃)，显色。AlphaImagar软件进行灰度扫描，然后进行统计分析，将数据导入Origin8软件进行制图。

1.7统计方法 运用SPSS18.0软件进行方差齐性检验、t检验、方差分析。

2 结 果

2.1大鼠存活情况 4 w后，39只大鼠存活，其中Control组10只，Iso组9只，Iso+SO2组10只，SO2组10只。

2.2各组心电图检测结果 与Control组相比，Iso组及Iso+SO2组心电图Ⅱ导联ST段明显抬高，Control 组和SO2组心电图无明显改变，提示Iso组及Iso+SO2组AMI模型建立成功。见图1。

2.3各组血浆肌钙蛋白T检测结果 与Control 组〔(34.445±5.246)pg/ml〕相比，Iso组〔(323.312±77.525)pg/ml〕及Iso+SO2组〔(316.755±58.615)pg/ml〕血浆肌钙蛋白T水平显著升高，Control 组和SO2组〔(34.531±4.716)pg/ml〕比较肌钙蛋白无明显改变，提示Iso组及Iso+SO2组AMI模型建立成功。

2.4各组Masson染色结果 Iso组大鼠心肌组织间的胶原纤维沉积较Control 组明显增多。Iso+SO2组大鼠心肌组织组织间胶原纤维沉积较Iso组明显较少。而SO2组与Control 组相比，大鼠心肌组织间的胶原纤维沉积未见明显差异。见图2。

2.5各组心肌组织中MMP-3、TIMP-1蛋白表达水平 与Control 组相比，Iso组心肌中MMP-3蛋白表达显著上调(P<0.05)，TIMP-1蛋白表达显著下调(P<0.05)，与Iso组相比，SO2+Iso组心肌中MMP-3蛋白表达显著下调(P<0.05)，TIMP-1蛋白表达显著上调(P<0.05)，而Control 组与SO2组相比，以上蛋白表达无显著差异(P>0.05)。见表1、图3。

A：Control组、B：Iso组、C：Iso+SO2组、D：SO2组；图2同图1 各组心电图

图2 各组心肌组织Masson染色(×400)

表1 各组MMP-3、TIMP-1蛋白表达水平比较

图3 各组心肌组织中MMP-3、TIMP-1蛋白表达

3 讨 论

Iso作为β受体激动剂，当大剂量作用于心脏时，将导致冠状动脉严重痉挛，进而导致心肌缺血缺氧，并诱发AMI，目前大剂量的Iso诱导已成为AMI大鼠常用的造模方法〔6，7〕。当AMI死后血运未及时得到重建，心肌细胞可由于缺血缺氧而发生大量坏死，进而导致心肌重构，而心肌重构主要表现为MF，MF可导致舒张功能障碍和心律失常，最终导致心力衰竭，本研究中Iso组大鼠在AMI后出现了明显MF，及时将AMI患者进行血运重建以及抑制MF直接关系到患者的预后及转归。

MMPs为一组锌离子依耐性内肽酶，可以特异性降解ECM，TIMPs是MMPs内源性抑制剂〔8〕，MMPs和TIMPs两者相互作用共同调控着体内ECM的动态平衡并参与了人体多个脏器纤维化过程〔9，10〕。MF主要表现为ECM在心肌间质异常沉积，急性心肌损伤后，各种炎症细胞因子和促纤维化因子增加，同时产生MMPs和TIMPs〔11〕，故调控MMPs及TIMPs的动态平衡在防治MF过程中发挥着重要作用，有研究发现MF的发展依赖于MMPs的上调及TIMPs的下调〔12〕。MMPs可根据底物、一级结构不同分为胶原酶、间质溶解素、明胶酶、弹性蛋白酶〔13〕，MMP-3是MMPs家族的一份子，为间质溶解素，MMP-11与MMP-3同属于间质溶解素，已有学者发现在高甲状腺诱导的MF过程中MMP-11明显上调〔14〕。TIMP-1是TIMPs家族按作用靶点不同分出的重要成员之一，其功能主要是抑制MMPs的活性，研究发现通过上调TIMP-1的表达可改善异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化〔12〕。本研究提示MMP-3和TIMP-1在AMI MF过程中可能发挥着重要作用。

内源性气体信号分子SO2是近年来新发现具有多种生物学效应的气体信号分子，其主要产生于含硫氨酸代谢中，同属于含硫氨酸代谢产物硫化氢、牛磺酸、同型半胱氨酸均已被证实在心血管功能调节中发挥着重要的生物学作用〔15〕，而SO2已发现具有调节心功能、舒张血管、保护心肌缺血再灌注损伤、改善高血压及肺动脉高压的作用〔16〕。有研究发现，SO2具有通过抑制细胞凋亡降低Iso所致的心肌细胞损伤〔4〕；也有学者发现，SO2可抑制细胞凋亡和内质网应激从而改善糖尿病大鼠心肌纤维化〔5〕。本实验发现SO2可改善AMI大鼠的MF。综上所述，SO2可能通过下调MMP-3蛋白表达和上调TIMP-1蛋白表达进而改善AMI大鼠后的MF，但其中更多内在调控机制仍需进一步研究。