橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡及JNK/p38 MAPK信号通路的影响

徐祖清 王诗洋 王枭 刘悦 金华

(1深圳市龙华区中心医院，广东 深圳 518000；2延边大学附属医院)

橄榄苦苷(oleuropein)为环烯醚类葡萄糖苷，广泛存在于木犀科植物中，在油橄榄叶中含量尤为丰富，具有器官保护、降血脂、降血压、降血糖、解毒、抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多种药理作用〔1～3〕。近年来，橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤的保护作用逐渐引起了人们的关注。橄榄苦苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用，该作用与抑制炎性反应有关〔4〕。此外，橄榄苦苷对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与减少自由基损伤及抗氧化作用有关〔5〕。本实验在进一步验证橄榄苦苷在保护大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤作用的基础上，着重研究该作用与神经元凋亡及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路的关系，初步阐明作用机制，从而为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1动物 清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠70只，雄性，体重200～220 g，购自上海西普尔必凯公司。

1.2试剂 橄榄苦苷购于上海沪震公司，纯度>95%；尼莫地平片为德国拜耳公司产品，规格为30 mg/片；2，5，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)由美国Sigma公司提供；实时定量聚合酶链反应(qPCR)测定试剂盒，大连宝生物公司。JNK、磷酸化(p)-JNK、p38及p-p38多克隆抗体，美国 Santa Cruz公司。

1.3仪器 MS-TS型分析天平，梅特勒-托利多(上海)公司；600-BS-Ⅱ型电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂；QuantstudioTMDX型定量PCR仪，美国ABI公司；Mini-3型垂直式蛋白电泳仪，美国 Bio-Rad公司。

1.4方法

1.4.1分组、给药及脑缺血再灌注损伤大鼠模型建立 SD大鼠按体重随机分为5组，即假手术组、模型组、尼莫地平组(0.5 mg/kg)及橄榄苦苷高、低剂量组(40、20 mg/kg)，每组14只。连续灌胃给药14 d，1次/d；末次给药结束后1 h，将麻醉后的大鼠固定于手术台。在颈部正中位置处切口，暴露颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)和左侧颈总动脉(CCA)，将ECA结扎使ECA主干一段游离。将CCA远心端结扎，近心端用动脉夹夹闭。剪一小口于ECA上，通过ECA将尼龙线栓插入ICA，缓慢推进约1 cm到达脑前动脉(ACA)处。进行2 h脑缺血后，将线栓抽出行再灌注24 h。假手术组无须插入尼龙线，其余步骤同上。

1.4.2神经症状评分测定 参照Bederson法〔6〕开展神经症状评分的测定。意识丧失或不能自发行走为3分；行走时向右侧倾倒或向右侧旋转为2分；不能完全伸直右前肢为1分；神经症状正常为0分。

1.4.3脑梗死面积测定 各组均取SD大鼠7只，在冰上迅速断头取脑，去除低位脑干、小脑和嗅球，由前向后行连续冠状切片，在37℃下用2%TTC溶液避光染色30 min。染色后脑梗死组织呈白色，正常组织呈玫瑰红色，利用计算机图像分析软件测定脑梗死面积。

1.4.4大脑组织含水量测定 各组剩余SD大鼠，在冰上迅速断头取脑，将大鼠两侧大脑半球切开，左右各取两侧基底节区和皮层区两个部位的脑组织200 mg，精密称量湿质量。在100℃烘箱中放置72 h，精密称量干质量，计算脑组织含水量。

1.4.5半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关x蛋白(Bax) mRNA表达测定 分离缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，Trizol法提取总RNA，并逆转录为cDNA，实时定量qPCR所需引物由南京金斯瑞生物公司合成。Caspase-3引物序列为上游：5′-AGCTTCTTCAGAGGCGACTA-3′，下 游：5′-GGACACAATACACGGGATCT-3′；Bcl-2引物序列为上游：5′-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3′，下 游：5′-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-3′；Bax引物序列为上游：5′-CGAGTGGTCTCCGGCGAATTG-3′，下 游：5′-ATGGTGAGCGAGGCGGTGAG-3′；内参β-actin 引物序列为上游：5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′，下 游：5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。实时定量qPCR反应体系及扩增条件，严格按照试剂盒说明书进行，通过2-ΔΔCt值计算各组mRNA相对表达水平。

1.4.6JNK/p38 MAPK信号通路蛋白表达测定 分离缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，液氮中研磨后加预冷的组织裂解液，裂解30 min，离心(12 000 r/min，10 min)，保留上清液。BCA法对蛋白含量进行测定，煮沸变性后，加上样缓冲液。经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白并转至聚偏二氟乙烯膜上；脱脂奶粉封闭后，分别加入JNK、p-JNK、p38及p-p38多克隆抗体，结合后再加入相应的二抗。显色、曝光后，拍照，分析各条带光密度值，计算各组目的蛋白相对表达量。

1.5数据处理与统计 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经症状评分的影响 假手术组大鼠神经症状正常，与假手术组比较，模型组大鼠神经症状评分显著增加〔(0.00±0.00)分 vs (2.55±0.34)分；P<0.05〕，表明大鼠脑缺血再灌注损伤模型建立成功。与模型组比较，尼莫地平及橄榄苦苷高、低剂量组大鼠神经症状评分均显著降低〔(1.32±0.17)分、(1.56±0.21)分、(1.81±0.18)分；P<0.05〕。

2.2橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积的影响 假手术组大鼠未出现脑梗死，而模型组大鼠有明显的脑梗死发生，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积显著增加(P<0.05)，进一步提示大鼠脑缺血再灌注损伤模型建立成功。与模型组比较，尼莫地平及橄榄苦苷高、低剂量组脑梗死面积均显著降低(P<0.05)。见图1及表1。

图1 橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积的影响

2.3橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量的影响 与假手术组比较，模型组脑组织含水量显著增加(P<0.05)；与模型组比较，尼莫地平及橄榄苦苷高、低剂量组脑组织含水量均有不同程度的降低，其中尼莫地平及橄榄苦苷高剂量组降低幅度显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑梗死面积及脑组织含水量比较

2.4橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Caspase-3、Bcl-2及Bax mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组脑组织Caspase-3及Bax mRNA表达显著增加(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，尼莫地平及橄榄苦苷高、低剂量组脑组织Caspase-3及Bax mRNA表达明显降低(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表达明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表达的影响

2.5橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠JNK/p38 MAPK信号通路的影响 假手术组p-JNK及p-p38蛋白低水平表达，与假手术组比较，模型组p-JNK及p-p38蛋白表达显著增加(P<0.05)，提示模型组大鼠JNK/p38 MAPK信号通路处于活化状态；与模型组比较，尼莫地平及橄榄苦苷高、低剂量组p-JNK及p-p38蛋白均显著降低(P<0.05)，见图2、表3。

1～5:假手术组、模型组、尼莫地平组、橄榄苦苷高剂量组、橄榄苦苷低剂量组图2 橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠JNK/p38 MAPK信号通路的影响

表3 橄榄苦苷对脑缺血再灌注损伤大鼠JNK/p38 MAPK信号通路的影响

3 讨 论

脑血管疾病以高发病率、 高死亡率、高致残率及高复发率为特点，为中老年人的常见疾病，是导致人类死亡的三大疾病之一〔7〕。脑血管疾病以脑卒中为主，其中80%患者为缺血性脑卒中，且该病近年来呈显著上升趋势，严重影响着人们的生活水平和生活质量〔8〕。脑缺血再灌注损伤是指血流再灌注后，进一步加重缺血性损伤的现象，而缓解此过程具有重要意义〔9〕。本研究结果表明橄榄苦苷具有保护脑缺血再灌注损伤的作用。

脑缺血再灌注损伤机制涉及细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性等，是一个复杂的病理过程，其中脑组织内神经细胞凋亡是导致再灌注损伤的重要机制之一〔10〕。研究发现〔11〕，发生脑缺血再灌注损伤时，凋亡细胞大量出现并伴随着损伤的加重呈逐渐增多趋势。Caspase家族与Bcl-2家族基因共同参与了由线粒体介导的细胞 “内源性途径”凋亡过程。Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶，其中Caspase-3在凋亡进行中扮演核心角色，抑制Caspase-3的表达对改善脑神经功能及降低脑血再灌注损伤具有积极的意义〔12〕。Bcl-2家族包括抗凋亡基因和促凋亡基因两大类，在脑缺血再灌注损伤中，抗凋亡基因Bcl-2被抑制，促凋亡基因Bax被活化，均有利于诱导缺血性神经细胞发生凋亡〔13，14〕。本研究结果表明橄榄苦苷具有抑制脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡作用。相关研究表明〔15〕，在脑缺血再灌注损伤中，MAPK信号通路尤为关键。近年来的研究也证实〔16〕，MAPK信号通路的相关蛋白JNK和 p38几乎参与了缺血性脑损伤的全部生理、病理过程，因而JNK/P38 MAPK信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用至关重要。JNK/p38 MAPK信号通路的活化，有助于神经元凋亡的发生，而阻断该信号通路，对缓解脑缺血再灌注损伤具有重要意义〔17〕。研究发现〔18〕，抑制JNK/p38 MAPK信号通路中JNK 和p38的磷酸化并降低p-JNK、p-p38蛋白含量，是全反式维A酸保护大鼠脑缺血再灌注损伤作用的主要机制。没食子酸丙酯对脑缺血再灌注模型大鼠神经元损伤的保护作用也与抑制JNK/p38 MAPK信号通路的激活有关〔19〕。本研究结果表明橄榄苦苷具有抑制脑缺血再灌注损伤大鼠JNK/p38 MAPK信号通路活化的作用。

综上所述，橄榄苦苷对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，该作用与抑制JNK/p38 MAPK信号通路的活化进而减少神经元凋亡有关。