胃泌素对胃癌细胞EMT和Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响

谢渊 李抄 张晓怡 陈定宇 赵艳 王琴容 周建奖

(贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

上皮间质转化(EMT)是上皮细胞在某些特定的生理或病理条件下，转化成为具有间质样表型细胞的生物学过程，是已知的肿瘤转移相关的核心生物学进程之一〔1〕。在此过程中上皮细胞的极性消失、迁移和运动能力增强，同时伴有上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(cadherin)的丢失、间质细胞标志物N-cadherin、Snail的表达、细胞骨架重排，使上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附，从而获得迁移和侵袭性使上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附，从而获得迁移和侵袭性〔2，3〕。

胃泌素(gastrin)是一种胃肠肽激素，由胃窦部G细胞产生，刺激胃酸分泌，其作为胃肠道的营养因子，参与胃肠黏膜的生长和修复。研究发现，gastrin可由胃肠肿瘤细胞异位产生，作为促生长因子，刺激肿瘤细胞的增殖和分化〔4〕。本课题组前期研究发现转移淋巴结中gastrin基因的表达量是原发胃癌组织的35倍〔5〕，gastrin可促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成拟态的形成，同时还增强肿瘤转移相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达，提示gastrin在促进胃癌的侵袭转移中起重要作用〔6，7〕。目前，胃癌细胞发生EMT并获得侵袭潜能的分子基础和作用机制并不十分清楚，胃癌细胞自分泌gastrin促进其侵袭转移是否与诱导EMT发生有关还有待进一步研究。本研究用过表达gastrin真核表达载体转染胃癌细胞系构建高表达gastrin细胞模型，采用Western印迹观察gastrin对胃癌细胞EMT的影响，并检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达变化，初步探索gastrin对胃癌EMT的影响。

1 材料和方法

1.1材料 人胃癌细胞 SGC-7901、MKN45购自中国科学院上海细胞库，gastrin过表达载体pcDNA3.1-gastrin由本课题组前期构建，由本实验室保存。RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；双抗、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；LipofectamineTM2000购自赛默飞世尔科技公司；质粒提取试剂盒、Western印迹配胶试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；羊抗兔E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、gastrin、wnt3α、羊抗兔二抗购自美国proteintech公司，c-myc购自abcam公司，gastrin PCR扩增引物序列(上游5′-GCTCTAG ACCATGCAGCGACTATGTGTGTAT-3′，下游5′-GCCCTAGGTCAGTTTTTCA GGGGACAG-3′)由上海生工合成。

1.2胃癌细胞株SGC-7901、MKN45的培养 胃癌细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640培养基中，置于5% CO2、37℃恒温培养箱培养，待细胞贴壁生长达80%以上融合度时进行传代，备用。

1.3pcDNA3.1-gastrin质粒提取及鉴定 取实验室液氮保存含pcDNA3.1-gastrin质粒的大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养14 h，挑取一个单菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养，220 r/min，37℃摇菌16 h。收集细菌细胞并按照质粒提取试剂盒操作步骤进行提取，定量及PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测gastrin基因。

1.4pcDNA3.1-gastrin质粒转染胃癌细胞 转染前24 h，将生长良好的胃癌细胞SGC-7901、MKN45消化后，加入无抗生素培养液制成单细胞悬液，计数后以5.0×105/孔的密度接种至6孔板，再加入2 ml/孔无抗生素培养液，过夜培养，待细胞融合率达70%～80%时进行转染。根据实际说明书建议及前期预试验结果，采用转染试剂∶质粒为5∶3进行转染，设置空白对照(control)组(空载体转染)、空载质粒pcDNA3.1转染(pcDNA3.1)组和pcDNA3.1-gastrin质粒转染(pcDNA3.1-gastrin)组。转染6 h后更换不含双抗的培养基继续培养，48 h后收集细胞备检。

1.5蛋白免疫印迹实验测定EMT、Wnt/β-catenin信号通路标志蛋白 取各组细胞，用RIPA裂解液充分裂解，提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量。取50 μg总蛋白上样，经10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)3 h，转膜2.5 h，封闭液封闭1 h；磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，10 min/次；各组分别加入羊抗兔一抗(E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、gastrin、wnt3α)4 ℃孵育过夜，用含0.05%Tween20的TBS(TBST)漂洗3 次，10 min/次；加入辣根过氧化物酶(HRP)二抗，37℃孵育1 h，同上漂洗后加入化学发光液显色，试验以GAPDH为内参。处理并读取灰度值，以目的条带与内参条带的平均灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。每组试验重复3次。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1pcDNA3.1-gastrin质粒PCR鉴定 取从大肠杆菌DH5α中提取的质粒pcDNA3.1-gastrin，用gastrin特异引物进行PCR扩增，电泳后可见大小为375 bp的目的片段，如图1所示。

2.2Western印迹检测SGC-7901、MKN45细胞中gastrin表达 在SGC-7901、MKN45两种细胞的各处理组中均检测到gastrin蛋白表达，pcDNA3.1-gastrin组较pcDNA3.1组gastrin表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2，表1。

M 标准分子量参照;1 pcDNA3.1-gastrin质粒PCR产物图1 pcDNA3.1-gastrin质粒PCR 鉴定

1～3：Control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-gastrin组，下图同图2 胃泌素在SGC-7901和MKN45细胞中的表达

表1 gastrin在胃癌细胞中的表达

2.3gastrin对EMT相关标志蛋白表达的影响 上皮标志蛋白E-cadherin在pcDNA3.1-gastrin组表达水平低于pcDNA3.1组，差异有统计学意义(P<0.01)；间质标志蛋白N-cadherin和相关转录因子sail1在pcDNA3.1-gastrin组表达水平高于pcDNA3.1组，差异有统计学意义(P<0.01)。提示表明高表达gastrin可促进EMT的发生，见表2，图3。

2.4gastrin对Wnt/β-catenin信号通路标志蛋白表达的影响 wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-myc在pcDNA3.1-gastrin组表达上调，与pcDNA3.1组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。提示表明高表达gastrin可激活Wnt/β-catenin信号通路，见图4，表3。

图3 gastrin对EMT相关标志蛋白表达的影响

表2 gastrin对EMT相关标志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail表达的影响

图4 gastrin对Wnt/β-catenin信号通路标志蛋白表达的影响

表3 gastrin对Wnt/β-catenin信号通路标志蛋白wnt3α、β-catenin 和c-myc表达的影响

3 讨 论

胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内的发病率和死亡率分别占全部肿瘤的第5位和第3位，其中，超过 70%的新发病例数发生在发展中国家，且以东亚地区为主〔8〕。中国属于胃癌高发国家，每年的胃癌新发病例数约占世界的40%〔9〕。通常原发肿瘤所导致的死亡仅占肿瘤死亡的10%，大部分患者是死于肿瘤的远处转移〔10〕。侵袭转移是胃癌重要的病理学特征，也是其治疗困难，预后不佳的主要原因之一，因此对胃癌发生发展、侵袭转移的研究极为重要。

近年来的研究发现，幽门螺杆菌感染、长期使用质子泵抑制剂导致的内源性高胃泌素血症及外源性gastrin在促进胃肠道恶性肿瘤的发生发展中起到重要的作用〔11,12〕，已有研究证实gastrin能促进胃肠肿瘤细胞的侵袭、转移〔13〕，临床上也已将血清gastrin作为胃癌及癌前疾病早期诊断的标志〔14〕。对于大多数肿瘤来说，在其向恶性发展的过程中总伴随着细胞向上皮分化能力的丧失，继而向间质样表型转化，发生EMT的细胞更容易迁移和侵袭，EMT通常被认为是诱发肿瘤浸润和转移的早期关键事件〔15〕。gastrin促进胃癌细胞侵袭转移是否与诱导EMT发生有关值得一步研究，因此本研究采用gastrin过表达质粒pcDNA3-gastrin转染胃癌细胞株SGC-7901、MKN45，检测过表达gastrin对EMT相关标志物表达量的变化，在两株细胞中一致发现gastrin可以引起E-cadherin表达下调，N-cadherin及相关转录因子Snail表达上调。E-cadherin是上皮细胞间的连接结构，负责将相邻细胞相互锚定并形成黏附连接，其表达下调或功能异常可引起上皮细胞形态改变、细胞间黏附减弱，细胞迁移能力增强，从而发生EMT〔16〕。 Snail 是锌指转录抑制因子家族中的一员，能强烈抑制E-cadherin mRNA 表达，通过促进EMT 来影响生物胚胎发育和肿瘤的发生发展〔17〕。N-cadherin是间质细胞间的连接结构，被认为是间质表型的标志物，是细胞迁移的关键。E-cadherin的下调N-cadherin和Snail的上调可以认为是EMT发生的标志，因此，推测gastrin可能通过促进EMT的发生来使胃癌细胞获得迁移、侵袭的能力。

Wnt/β-catenin信号传导途径是一类传导生长刺激信号的通路，由细胞外的Wnt蛋白、膜受体Frizzled、胞质内的β-catenin 及下游的转录因子组成〔18〕。Wnt基因被异常激活，可抑制糖原合成激酶/结直肠腺瘤性息肉/轴蛋白(GSK3p/APC/Axin)复合物对β-catenin 的磷酸化，减少β-catenin的降解，使β-catenin在细胞内聚积并向核内转移，与转录因子TCF/LEF相互作用，调节众多EMT相关蛋白如E-cadherin、Fibronectin、MMP7、Snail、Twist 等的表达诱导EMT发生〔19〕。β-catenin可与E-cadherin胞内区结合形成P-catenin/E-cadherin复合体，再与肌动蛋白骨架相连，减弱细胞间黏附，诱导肿瘤的EMT过程从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力〔20〕。本实验检测高表达gastrin对wnt/β-catenin信号通路相关基因wnt3α、β-catenin、c-myc表达的影响，发现胃泌素可使wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-Myc表达上调，表明gastrin对Wnt/β-catenin信号通路有一定的活化作用，而胃泌素引起上皮间质转化可能与Wnt/β-catenin信号通路的异常激活有关。